Ghsr-/-小鼠黑質(zhì)ATP敏感性鉀通道亞基表達(dá)改變

呂吉榮,肖雪,焦倩,陳曦,杜希恂,姜宏

(青島大學(xué)國家生理學(xué)重點(diǎn)(培育)學(xué)科,山東 青島 266071)

生長激素促分泌素受體1a(GHSR1a)是一種廣泛分布在下丘腦、垂體、腹側(cè)被蓋區(qū)、中縫核、海馬和黑質(zhì)致密部等區(qū)域的G蛋白偶聯(lián)受體[1]。ghrelin是其唯一的內(nèi)源性配體[2]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果證實(shí)，ghrelin-GHSR1a可以通過改善線粒體功能，拮抗魚藤酮和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的多巴胺(DA)能神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[3-4]。同時(shí)，GHSR1a還具有本構(gòu)型活性，即在缺乏配體或激動(dòng)劑的情況下，受體仍能自發(fā)地維持激活并維持下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性[5-6]。已有研究結(jié)果表明，在小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)立體定位注射GHSR1a拮抗劑可誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元中GHSR1a表達(dá)下調(diào)，并導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙[7]。

ATP敏感性鉀通道(KATP通道)作為一種內(nèi)向整流鉀通道，由4個(gè)內(nèi)向整流鉀通道Kir6.X亞基(Kir6.1或Kir6.2)和4個(gè)磺酰脲受體(SUR)亞基組成，具有改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平和穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的作用[8-10]。近年來的研究表明，KATP通道的選擇性激活可能參與了帕金森病(PD)中黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷[11-12]。PD病人尸檢結(jié)果顯示，腦內(nèi)黑質(zhì)殘存的DA能神經(jīng)元上雖然同時(shí)表達(dá)有SUR1、SUR2B和Kir6.2等3種不同類型的KATP通道，但只有SUR1mRNA水平顯著升高，其余亞基表達(dá)均無改變[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果證實(shí)，在3、6和9月齡的PD轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)中KATP通道SUR1亞基的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)。亦有研究證實(shí)，ghrelin-GHSR1a可以通過激活KATP通道調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)節(jié)狀神經(jīng)核的興奮性。而GHSR1a是否也參與調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展過程中KATP通道各亞單位的表達(dá)變化尚不清楚。因此，本研究選取3月齡GHSR1a敲除(Ghsr-/-)小鼠和同窩野生型(WT)小鼠，應(yīng)用蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)黑質(zhì)的KATP通道各亞基蛋白及mRNA水平進(jìn)行檢測，為闡明GHSR1a與KATP通道在PD發(fā)病中的相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所用Ghsr-/-小鼠均購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。Ghsr+/-小鼠與Ghsr+/-小鼠雜交得到下一代小鼠，通過基因鑒定得到Ghsr-/-小鼠及相應(yīng)的同窩WT小鼠。本實(shí)驗(yàn)選用3月齡的Ghsr-/-雄性小鼠和同窩WT雄性小鼠作為研究對(duì)象，每組5只。小鼠在室溫(23±1)℃、12 h晝夜循環(huán)光照的環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)，可自由飲水與進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 SUR1抗體、SUR2B抗體、Kir6.2抗體均購自美國Abcam公司；β-actin抗體購自中國Bioss公司；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司；SDS-PAGE分離膠緩沖液和SDS-PAGE濃縮膠緩沖液均購自美國Sigma公司；ECL發(fā)光液、PVDF膜購自美國Millpore公司；RIPA裂解液、過硫酸銨(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、BCA試劑盒、Loading buffer均購自中國碧云天公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；SYBR Premix Ex Taq(2×)購自日本Takara公司。所用實(shí)驗(yàn)儀器包括電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)、高速低溫離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、分光光度計(jì)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)液體配制 0.01 mol/L PBS：稱取4.0 g Na2HPO4·12H2O、0.4 g NaH2PO4·2H2O以及9.0 g NaCl，用雙蒸水定容至1 L。電泳緩沖液：稱取Tris 1.51 g、甘氨酸7.20 g、SDS 0.50 g,使用雙蒸水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值至8.3。轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取Tris 3.0 g、甘氨酸14.4 g，分別加入800 mL的雙蒸水和200 mL的甲醇，調(diào)節(jié)pH值至8.3。TBST溶液：稱取Tris 2.42 g、NaCl 8.00 g，用雙蒸水定容至1 L，加入1 mL Tween-20，調(diào)節(jié)pH至7.5。封閉液：用TBST溶液配制的50 g/L脫脂奶粉。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測黑質(zhì)SUR1、SUR2B和Kir6.2蛋白的表達(dá)

小鼠用異氟烷深度麻醉后，斷頭取腦。根據(jù)腦圖譜，分別取出大腦雙側(cè)黑質(zhì)區(qū)域，并置于預(yù)冷的1.5 mL EP管中，分別向EP管內(nèi)加入100 μL的RIPA裂解液。在冰上用電動(dòng)研磨棒充分研磨至管內(nèi)腦組織完全溶解，再置于冰上裂解30 min。把裂解好的組織放入離心機(jī)中，在4 ℃下以12 000 r/min的速度離心20 min。離心后取出EP管，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，應(yīng)用BCA法測定波長562 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出待測樣本的濃度。配制100 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，按照樣品上樣量準(zhǔn)確上樣，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中，室溫?fù)u床孵育2 h；分別加入一抗SUR1(1∶1 000)、SUR2B(1∶1 000)、Kir6.2(1∶1 000)以及β-actin(1∶1 000)，于4 ℃搖床上低速搖動(dòng)孵育過夜；用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min；加入用1×TBST溶液配制的山羊抗兔二抗(1∶10 000)、山羊抗鼠二抗(1∶10 000)，室溫?fù)u床孵育1.5 h；再用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于ECL顯影液中孵育1 min，再將PVDF膜置于顯影儀中顯影并拍攝。用Image J 10.0分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，以SUR1、SUR2B、Kir6.2與β-actin的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測黑質(zhì)中SUR1、SUR2B和Kir6.2的mRNA表達(dá)

用TRIzol提取小鼠黑質(zhì)RNA，按照Thermo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，配制兩步反應(yīng)體系，先42 ℃變性60 min、25 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，然后升溫至70 ℃、作用5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，于4 ℃冷卻，將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測目的基因SUR1、SUR2B、Kir6.2及內(nèi)參照基因GAPDH的表達(dá)，按照熒光定量PCR說明書配制PCR反應(yīng)體系，采用兩步法經(jīng)過40個(gè)循環(huán)完成擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增引物及其序列見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 PCR引物及其序列

2 結(jié) 果

2.1 Ghsr-/-小鼠黑質(zhì)SUR1、SUR2B、Kir6.2的蛋白表達(dá)變化

Ghsr-/-組和WT組3月齡小鼠黑質(zhì)KATP通道亞基SUR1蛋白表達(dá)水平分別為0.996±0.120和0.473±0.076(n=5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.389，P<0.05)；SUR2B蛋白表達(dá)水平分別為0.899±0.142和0.798±0.118(n=5)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.492，P>0.05)；Kir6.2蛋白表達(dá)水平分別為0.827±0.081和0.728±0.065(n=5)，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.860，P>0.05)。

2.2 Ghsr-/-小鼠黑質(zhì)SUR1、SUR2B、Kir6.2的mRNA表達(dá)變化

Ghsr-/-組和WT組3月齡小鼠黑質(zhì)KATP通道亞基SUR1mRNA的表達(dá)水平分別為1.024±0.074和0.990±0.047(n=5)，SUR2BmRNA的表達(dá)水平分別為1.012±0.082和1.212±0.421(n=5)，而Kir6.2mRNA的表達(dá)水平分別為1.137±0.466和1.209±0.118(n=5)，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.294～1.546，P>0.05)。

3 討 論

GHSR1a和KATP通道都廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[13-14]。GHSR1a主要通過與ghrelin結(jié)合發(fā)揮作用，但是其在缺乏配體激活時(shí)也能夠?qū)W(xué)習(xí)記憶、生長發(fā)育等發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這就是GHSR1a的本構(gòu)型活性[15]。先前有研究結(jié)果表明，GHSR1a和多巴胺受體1型(DRD1)結(jié)合可以在中腦和海馬的神經(jīng)元亞群中共表達(dá)，且可在體外形成異源二聚體，從而進(jìn)一步修飾G蛋白，擴(kuò)增DA信號(hào)[16-18]。然而，在PD特異性誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來源的DA能神經(jīng)元中GHSR1a的表達(dá)顯著降低，提示GHSR1a與PD密切相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)選取Ghsr-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過蛋白免疫印跡法檢測到腦內(nèi)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元KATP通道SUR1亞基蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而SUR2B、Kir6.2亞基蛋白表達(dá)均未發(fā)生明顯改變。本研究同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測了KATP通道各亞基mRNA表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，Ghsr-/-小鼠黑質(zhì)SUR1、SUR2B及Kir6.2的mRNA表達(dá)水平均未發(fā)生改變。我們推測這可能與GHSR1a基因敲除后DA能神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)降解異常有關(guān)，GHSR1a基因敲除一方面可能引起神經(jīng)元內(nèi)自噬的過度激活，另一方面可能引起蛋白泛素化水平異常，使蛋白降解增加。但具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

SUR1是構(gòu)成KATP通道的亞基之一，屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)蛋白家族，它主要調(diào)節(jié)KATP通道對(duì)ATP、腺苷和藥物的敏感性[20-22]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，攜帶人A53T突變型α-syn的轉(zhuǎn)基因PD模型小鼠黑質(zhì)KATP通道的SUR1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Kir6.2和SUR2B的表達(dá)無明顯變化。另有研究結(jié)果顯示，PD病人DA能神經(jīng)元中SUR1的表達(dá)水平比正常人高2倍[23]。KATP通道SUR1亞單位的表達(dá)上調(diào)能夠激活腺苷酸激活蛋白激酶，促進(jìn)KATP通道的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而促進(jìn)其開放[24-25]。但是在PD發(fā)病過程中，SUR1的表達(dá)異常對(duì)于黑質(zhì)DA能神經(jīng)元具有何種作用尚不明確。到目前為止，KATP通道在PD中的作用還存在一定的爭議。在PD發(fā)病早期，KATP通道的激活可以促進(jìn)DA釋放，從而保護(hù)神經(jīng)元。然而，隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，KATP通道會(huì)持續(xù)激活，造成DA能神經(jīng)元損傷[26-27]。因此，由GHSR1a基因敲除介導(dǎo)的KATP通道SUR1亞單位表達(dá)變化的機(jī)制及其在PD中的作用還有待于進(jìn)一步探討。本文研究結(jié)果為GHSR1a與KATP通道在PD中的作用研究提供了理論依據(jù)。