地西他濱聯合CAG方案治療復發(fā)急性髓細胞白血病患者的療效及對miR-34b、USP22表達的影響

朱 斌，王素麗，潘韶英，丁志勇，肖林林，趙文理

0 引言

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是急性白血病中發(fā)病率最高、生存率最低的異質性疾病，且年齡越大，化療緩解率越低，預后往往不佳[1]。異基因造血干細胞移植是AML的有效治療方法，但AML復發(fā)是導致治療失敗的重要原因[2]。AML的復發(fā)機制與復發(fā)后靶向治療的研究一直是該領域學者關注的焦點和面臨的巨大挑戰(zhàn)。前期研究發(fā)現，甲基化介導的microRNA-34b(miR-34b)及其下游、特異性泛素蛋白酶22(Ubiquitin protease 22，USP22)在初診及復發(fā)AML中均有異常表達，參與了AML的發(fā)生發(fā)展[3]。地西他濱作為一種特異性DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferas，DNMT)抑制劑，可能參與了逆轉DNA甲基化過程，激活沉默失活的抑癌基因，促進腫瘤細胞正常分化，在骨髓增生異常綜合征中取得明確療效，但其對復發(fā)AML的應用效果仍缺乏足夠證據[4]。本研究對復發(fā)AML患者采用地西他濱聯合CAG方案進行治療，探討該方案對miR-34b及其靶基因USP22表達、預后的影響。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2016年6月至2018年6月上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院收治入院的復發(fā)AML患者。入選標準：①符合中華醫(yī)學會血液學分會白血病淋巴瘤學組制定的《急性髓系白血病(復發(fā)難治性)中國診療指南(2017年版)》[5]的診斷標準，即完全緩解后外周血白細胞或骨髓原始細胞>5%，髓外可見白細胞細胞浸潤；②55～75歲，能夠配合隨訪。排除標準：①初治AML病例；②合并其他惡性腫瘤；③對化療藥物不耐受；④嚴重心肝腎功能障礙者。共入選30例患者，其中男16例，女14例，年齡55～74歲，平均(61.4±4.5)歲；FAB分型：M1 2例，M2 5例，M4 11例，M5 12例。按照隨機數字表法，將30例患者分為治療組和對照組，每組各15例。兩組的性別、年齡、FAB分型等基本資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批號：2018-KY-01)，患者或家屬均知情同意。

1.2 方法 治療組采用地西他濱聯合CAG方案，對照組采用CAG方案。地西他濱聯合CAG方案為地西他濱10 mg/m2，d1～d5：粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(杭州九源，國藥準字S10980030,規(guī)格：100 μg)300 μg，d2起(WBC>20×109/L時停藥)；阿克拉霉素(Acla)(深圳萬樂，國藥準字H10910093，規(guī)格：10 mg)20 mg/d，d3～d6；阿糖胞苷(Ara-C)(輝瑞制藥有限公司，國藥準字H20080412，規(guī)格：100 mg)10 mg/m2，每12 h皮下注射1次，d1～d7。對照組CAG方案，具體為G-CSF 300 μg d0起(WBC>20×109/L時停藥)，Acla 20 mg/d，d1～d4，Ara-C 10 mg/m2，每12 h皮下注射1次，d1～d14?；颊咧辽俳邮?個療程的治療。

1.3 觀察指標

1.3.1 化療療效 按照《血液病診斷及療效標準(第三版)》[6]對化療療效進行評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、未緩解(NR)?？偩徑饴?ORR)=(CR+PR)/總病例×100%。

1.3.2 miR-34b、USP22檢測 分別于化療前、化療后42 d行骨髓穿刺，抽取骨髓液3 ml，加入Ficoll分離液分離單核細胞，采用RIPA細胞裂解液提取蛋白，采用Western印跡檢測miR-34b、USP22蛋白表達。以GAPHD為內參，利用Image J軟件分析靶基因灰度值/β-actin灰度值，作為miR-34b、USP22蛋白相對表達量。

1.3.3 隨訪 采用電話、門診或上門等方式對患者進行隨訪，前半年每2個月1次，記錄患者生存情況及總生存(OS)期，OS期定義為確診復發(fā)至死亡(任何原因)或隨訪截止日期。

2 結果

2.1 兩組患者化療療效比較 治療組ORR為66.67%，顯著高于對照組的26.67%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.82，P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者化療療效比較[例(%)]

2.2 兩組患者外周血單核細胞miR-34b、USP22蛋白表達水平比較 化療前，兩組miR-34b、USP22蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；熀螅委熃MmiR-34b蛋白表達升高，USP22蛋白表達降低，且與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者外周血單核細胞miR-34b、USP22蛋白表達水平比較

2.3 兩組患者預后分析 對患者隨訪24～48個月，中位隨訪時間29.6個月，治療組存活8例，生存率為53.3%，對照組存活5例，生存率為33.3%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.22，P>0.05)。Kaplan-Meier法分析顯示，復發(fā)AML患者中位OS期為8.45個月(95%CI:7.65～9.25)，其中治療組中位OS期為9.53個月(95%CI:7.94～11.11)，顯著高于對照組6.57個月(95%CI:5.21～7.92)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.52，P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組患者生存曲線比較

2.4 兩組患者miR-34b、USP22蛋白表達與預后的相關性 與存活組比較，死亡組化療后miR-34b蛋白表達明顯降低，USP22蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 miR-34b、USP22蛋白表達與預后的相關性

3 討論

目前，CAG方案是AML臨床治療中廣泛應用的一種化療方案，可通過綜合化療、誘導分化及誘導凋亡充分發(fā)揮協(xié)同效應，提升化療藥物對腫瘤細胞的殺滅作用[7]。研究顯示，CAG早期誘導方案可有效提高初治AML患者的CR，但30%～40%的患者存在原發(fā)耐藥性，且50歲以上患者易復發(fā)[8]。受個體差異、合并疾病、骨髓造血能力、分子遺傳學等因素的影響，CAG方案對于復發(fā)AML患者的臨床療效并不理想，多數患者往往無法耐受強化誘導的毒副作用，即使應用減低劑量預處理方案與輔助支持技術，異基因造血干細胞移植也難以使之獲益，最終導致患者死于AML各種相關并發(fā)癥。

隨著測序技術的發(fā)展，AML患者編碼參與轉錄表觀調節(jié)蛋白的基因頻發(fā)突變已得到證實。DNA甲基化、miRNA等表觀遺傳學機制可在不改變DNA序列的情況下對基因表達和細胞表型進行調控，其在AML發(fā)生發(fā)展中的作用愈發(fā)引人關注[9]。生理情況下，與DNA啟動子區(qū)CpG島相關的CpG一般處于非甲基化狀態(tài)，基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化修飾是導致基因沉默的重要機制，而miR-34b可通過調節(jié)下游特定靶基因USP22的表達，影響AML細胞的抑制活性，miR-34b、USP22表達水平高低又直接影響其啟動子區(qū)DNA甲基化[10]。地西他濱主要通過抑制DNMT，使基因組中高甲基化CpG島去甲基化，重新活化抑癌基因，但基本不影響已處于低甲基化狀態(tài)的其他基因[11]。此外，有研究證實，低濃度地西他濱具有去甲基化作用，使沉默基因恢復表達，而當濃度升高時還可發(fā)揮細胞毒作用[12]。

本研究結果顯示，治療組化療后ORR、miR-34b及USP22蛋白表達均顯著優(yōu)于對照組，與Khan等[13]研究結果一致，表明地西他濱聯合CAG方案可明顯提高化療敏感性和緩解率，使復發(fā)AML獲益。郭健欣等[14]研究顯示，經地西他濱處理后，HL-60、K562細胞株miR-34b蛋白表達水平顯著增加，甲基化明顯抑制，細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。Zhou等[15]研究報道，USP22 mRNA在初診、緩解AML中的表達量較正常人群均上調，且USP22高表達患者的誘導緩解率明顯低于低表達者。

隨訪發(fā)現，兩種方案患者的3年生存率差異無統(tǒng)計學意義，考慮與納入的樣本量較小有關，但治療組中位OS期顯著高于對照組，進一步證實了地西他濱聯合CAG方案有助于延長生存期，改善患者預后。此外，與存活組比較，死亡組化療后miR-34b蛋白表達明顯降低，USP22蛋白表達明顯升高，提示miR-34b、USP22表達與患者預后可能存在相關性，由此推測過表達miR-34b或抑制USP22表達，調控異常的高甲基化水平可能成為復發(fā)AML治療的新靶點，可作為判斷復發(fā)AML預后的標志基因之一[16]。

綜上所述，地西他濱聯合CAG方案治療復發(fā)AML患者可能通過調控miR-34b及其下游靶基因USP 22的表達，逆轉AML相關基因啟動子區(qū)的正常甲基化，有效提高緩解率，延長生存期，改善預后。