沉默NOX4對百草枯誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

李 詠，程 靜，盧 立，賀文娟，劉 立，宋紅萍，吳 濤

0 引言

百草枯(Paraquat，PQ)是一種高效能的農(nóng)作物除草劑，對人畜具有很強的毒性，其誘導(dǎo)的實驗性肺纖維化模型廣泛用于肺纖維化發(fā)生機制和治療策略研究[1]。既往研究顯示，還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)與肺纖維化關(guān)系密切。NOX4可能通過促進ROS的大量產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激損傷，參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[2]。本研究旨在探討NOX4在百草枯誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮樣A549細胞氧化應(yīng)激和凋亡中的作用，揭示百草枯誘導(dǎo)肺纖維化的機制，也為肺纖維化治療提供新的可能靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑 人肺泡Ⅱ型上皮樣細胞A549來自中國科學(xué)院上海細胞庫；百草枯(Paraquat)購自美國Sigma-Aldrich公司；胰酶、PBS購自北京Solarbio科技有限公司；F12K完全培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM購自美國Gibco公司；Trizol、Lipofectamine?RNAiMAX購自美國Invitrogen公司；Real-time PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司；PCR引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自北京Solarbio科技有限公司；細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；β-actin(no.4967)一抗購自美國CST公司；丙二醛(MDA)ELISA檢測試劑盒(HM10250)、NOX4(PAB30655)一抗購自武漢Bioswamp生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)；ROS-S15實驗室超純水機(武漢吉百瑞公司)；Icen-24R高速冷凍離心機(杭州奧盛公司)；凝膠成像儀(ChemiDoc XRS，Bio-Rad公司)；CFX-Connect 96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一電子儀器公司)；ACEA NovoCyte流式細胞儀(美國艾森生物公司)。

1.1.3 細胞培養(yǎng)與試劑配制 人肺泡Ⅱ型上皮樣細胞A549培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱，常規(guī)消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行試驗。百草枯用生理鹽水溶解配制。

1.2 NOX4-siRNA設(shè)計與篩選

1.2.1 NOX4-siRNA的設(shè)計合成 針對NOX4的siRNA和陰性對照siRNA(siN0000001-1-5)由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成，序列見表1。采用Blast查詢驗證，排除與其他基因同源。

表1 NOX4小干擾RNA序列

1.2.2 NOX4-siRNA的篩選 取對數(shù)生長期的A549細胞，消化、離心，收集細胞。用含有血清的完全培養(yǎng)基重懸細胞，以5×105的細胞密度接種于6孔板中。待細胞生長至90%融合時進行轉(zhuǎn)染。細胞分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染)、3個實驗組(轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA-1組、轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA-2組、轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA-3組)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)組。每個轉(zhuǎn)染樣品按如下方法操作：取100 pmol siRNA稀釋于250 μl Opti-MEM，另取5 μl Lipofectamine?RNAiMAX稀釋于250 μl Opti-MEM，室溫下靜置5 min，再將2種溶液混勻，室溫孵育20 min，使形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液。將500 μl復(fù)合物溶液加入到細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，采用RT-PCR和Western blot方法檢測NOX4表達情況，篩選出最佳干擾質(zhì)粒，進行后續(xù)實驗。

RT-PCR檢測NOX4 mRNA的表達：細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，按Trizol試劑說明書提取細胞總RNA；采用特異性下游引物法將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后，以GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR檢測干擾效率，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、56 ℃退火10 s及72 ℃延伸25 s，進行40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，在CFX-Connect 96熒光定量PCR儀上進行，實驗重復(fù)3次。NOX4引物序列：上游為5′-CAACTGAAACCAAAGCAAC-3′，下游為5′-CAAACCAACGGAAGGAC-3′。GAPDH序列：上游為5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游為5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。

Western blot檢測細胞NOX4蛋白表達：細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞；吸去培養(yǎng)液，以適量預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次；吸去PBS，按照每1×106個細胞加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液200 μl，4 ℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 ml EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000 g離心10 min，取上清，進行蛋白質(zhì)定量。各組取等量細胞總蛋白(20 μg)于SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；與抗NOX4一抗稀釋液(1∶1 000)和抗GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜，洗膜；加入HRP標(biāo)記二抗稀釋液(1∶10 000)室溫孵育1 h，洗膜；ECL化學(xué)發(fā)光顯色，將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。依據(jù)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的NOX4蛋白表達量，篩選出最佳干擾質(zhì)粒，進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組及細胞轉(zhuǎn)染 后續(xù)實驗將A549細胞隨機分為：①對照組(細胞正常培養(yǎng)，不做任何處理)；②PQ組(細胞以700 μM PQ處理24 h)；③PQ+NOX4-siRNA組(細胞轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA 48 h后，再以700 μM PQ處理24 h)；④NOX4-siRNA組(細胞僅轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA)。細胞轉(zhuǎn)染前24 h，在2 ml完全培養(yǎng)基中接種5×105個細胞，種于6孔板，轉(zhuǎn)染時細胞融合度為90%。轉(zhuǎn)染操作如“1.5”所述。將細胞板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染完成后加入PQ(700 μM)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK-8檢測 A549細胞以PQ處理24 h，取出細胞培養(yǎng)板，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔，每組設(shè)定3個復(fù)孔。

1.5 ELISA檢測 A549細胞以PQ處理24 h，以PBS沖洗細胞，-80 ℃反復(fù)凍融使細胞破壞并釋放出細胞內(nèi)成分。按照試劑盒說明書操作檢測MDA含量。實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 A549細胞以PQ處理24 h，常規(guī)胰酶消化各組細胞，收集細胞；PBS輕洗細胞1次；加入195 μl Binding Buffer重懸細胞；細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC試劑，混勻后4 ℃避光孵育20 min；400 g離心5 min，小心棄上清液；加入190 μl Binding Buffer重懸細胞；細胞懸液中加入10 μl PI輕輕混勻，4 ℃避光孵育5 min，1 h內(nèi)送檢分析，實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細胞儀檢測細胞ROS水平 A549細胞以PQ處理24 h，常規(guī)胰酶消化各組細胞；按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM；細胞收集后懸浮于1 ml稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為1×106/ml，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min；每隔3 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸；用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA；收集各組細胞，500 μl PBS重懸，1×106/ml，上流式細胞儀檢測ROS；使用 NovoCyte 分析軟件進行分析。

1.8 Western blot檢測 A549細胞以PQ處理24 h，收集細胞，進行Western blot檢測，操作同“1.5”。目標(biāo)蛋白NOX4一抗稀釋比例為1∶1 000，內(nèi)參β-actin稀釋比例為1∶1 000，HRP標(biāo)記二抗稀釋比例為1∶20 000。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 篩選最佳干擾siRNA 采用RT-PCR法和Western blot方法從3對siRNA中篩選出最佳RNA干擾序列(圖1)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NOX4-siRNA-1組干擾效率最高且NOX4蛋白表達水平最低。因此，選定NOX4-siRNA-1對應(yīng)的序列進行后續(xù)細胞實驗。

圖1 NOX4 siRNA的篩選注：A.RT-PCR結(jié)果；B.Western blot結(jié)果。**與對照組比較，P<0.01

2.2 siRNA對PQ誘導(dǎo)A549細胞NOX4表達的影響 采用Western blot方法檢測NOX4蛋白表達，結(jié)果表明，PQ誘導(dǎo)NOX4表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與PQ組相比，轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA能夠明顯減少NOX4的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 沉默NOX4抑制PQ誘導(dǎo)的A549細胞NOX4表達注：與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01；與PQ組比較，##P<0.01

2.3 siRNA對PQ誘導(dǎo)A549細胞活力和MDA的影響 PQ(700 μM)誘導(dǎo)A549細胞24 h后，細胞活力受到明顯抑制(P<0.01)；PQ+NOX4 siRNA組細胞的活力升高，與PQ組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3A)。PQ(700 μM)作用于A549細胞24 h誘導(dǎo)MDA含量明顯增加(P<0.01)；與PQ組相比，siRNA能夠明顯減少A549細胞MDA產(chǎn)生(P<0.01)，見圖3B。

圖3 沉默NOX4減輕PQ誘導(dǎo)的A549細胞毒性及MDA生成注：A.細胞活力(%)；B.MDA含量(nmol/L)。與對照組比較，**P<0.01；與PQ組比較，##P<0.01

2.4 siRNA對PQ誘導(dǎo)A549細胞凋亡的影響 PQ(700 μM)作用于A549細胞24 h后，各組細胞凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。其中PQ組凋亡率高于對照組(P<0.01)；與PQ組相比，siRNA可降低A549細胞凋亡率(P<0.01)，見圖4。

圖4 沉默NOX4減輕PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡率注：A.對照組；B.PQ組；C.PQ+NOX4 siRNA組；D.NOX4 siRNA組。**與對照組比較，P<0.01；##與PQ組比較，P<0.01

2.5 siRNA對PQ誘導(dǎo)A549細胞氧化應(yīng)激(ROS)的影響 采用流式細胞術(shù)檢測A549細胞ROS水平，結(jié)果表明，PQ誘導(dǎo)A549細胞ROS水平顯著升高(P<0.01)；與PQ組相比，轉(zhuǎn)染NOX4 siRNA能夠明顯降低ROS水平(P<0.01)，如圖5。

圖5 沉默NOX4減少PQ誘導(dǎo)的A549細胞活性氧注：A.對照組；B.PQ組；C.PQ+NOX4 siRNA組；D.NOX4 siRNA組。**與對照組比較，P<0.01;##與PQ組比較，P<0.01

3 討論

肺纖維化是以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，至今缺乏有效的治療手段。體內(nèi)外模型是研究肺纖維化發(fā)病機制的有力工具。研究者采用了多種方法建立肺纖維化模型，包括石棉微粒誘導(dǎo)、博來霉素誘導(dǎo)、平陽霉素誘導(dǎo)和百草枯誘導(dǎo)等；其中，百草枯的靶器官為肺臟，使用百草枯誘導(dǎo)動物肺纖維化常選用小鼠、大鼠、家兔等，采用一次性口服灌注和腹腔注射的給藥方式[3]。百草枯為聯(lián)吡啶類化合物，化學(xué)名為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶鎓鹽，是一種速效除草劑，具有類似多胺的結(jié)構(gòu)，易被肺泡I型上皮細胞和肺泡II型上皮細胞主動攝取，因此百草枯在肺內(nèi)高度濃集，使得肺臟成為主要的毒性靶器官，最終形成纖維化[4]。

目前認(rèn)為百草枯導(dǎo)致肺纖維化的機制主要包括DNA損傷、氧化損傷、肺泡損傷、細胞因子網(wǎng)絡(luò)等[5]。百草枯中毒造成的肺損傷主要與活性氧、過度脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化氫物及谷胱甘肽含量減少有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多個活性氧(Reactive oxygen species，ROS)相關(guān)途徑的信號分子水平增加，例如NOX上調(diào)、血管緊張素Ⅱ激活、活性氧調(diào)節(jié)劑水平上升等，可以促進ROS的生成，參與纖維化的發(fā)生發(fā)展[6]。NOX家族是細胞ROS的主要來源，由以下幾種同工酶組成：NOX1-NOX5和雙重氧化酶。最新研究顯示，NOX4在多種因素誘導(dǎo)的肺纖維化中均發(fā)揮重要作用。NOX4在特發(fā)性肺纖維化患者和肺纖維化小鼠模型的肺泡Ⅱ型細胞上均呈現(xiàn)高表達，生成過量ROS，使細胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重氧化損傷，并且進一步激活p53，誘導(dǎo)AECs凋亡[7]。本實驗結(jié)果顯示，PQ誘導(dǎo)A549細胞NOX4高表達，伴隨著A549細胞凋亡率明顯增加，而采用siRNA沉默NOX4表達則明顯抑制了PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡，顯示NOX4在PQ誘導(dǎo)A549細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，NOX4有可能成為肺纖維化的治療靶點。

近年還發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)啟動的凋亡途徑是一種新的凋亡途徑[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白累積的一種適應(yīng)性應(yīng)答方式，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過強或持續(xù)時間過長，超過細胞自身的調(diào)節(jié)能力，則能夠通過激活下游促凋亡信號分子，如CHOP、caspase-12等來誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。氧化應(yīng)激狀態(tài)能夠誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)功能失調(diào)，生成大量未折疊蛋白質(zhì)，通過激活復(fù)雜的細胞質(zhì)和細胞核信號通路誘導(dǎo)ERS。Xu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PQ在體外能夠誘導(dǎo)A549細胞凋亡信號分子Bax、GRP78和CHOP表達上調(diào)，這一效應(yīng)可被抗氧化劑所拮抗，顯示PQ通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷啟動AEC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。本實驗結(jié)果表明，采用siRNA沉默NOX4表達能夠明顯抑制PQ誘導(dǎo)的A549細胞ROS產(chǎn)生，推測NOX4介導(dǎo)了PQ誘導(dǎo)A549細胞氧化應(yīng)激和凋亡的效應(yīng)。

綜上，本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染的方式，利用PQ誘導(dǎo)體外肺纖維化模型探究NOX4在肺纖維化中的作用與機制，為肺纖維化提供了新的可能治療靶點。今后擬使用NOX4穩(wěn)定低表達的慢病毒載體和基因敲除動物繼續(xù)開展研究。