替格瑞洛對(duì)家兔血小板功能及手術(shù)出血量的影響

劉炎東，李君晴，曾祥剛*

0 引言

替格瑞洛是一種P2Y12受體抑制劑，是最新指南推薦用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的一種新型且有效的抗血小板藥物[1]。既往研究顯示，接受冠脈支架植入治療冠心病的患者在2年內(nèi)行非心臟手術(shù)的幾率約為20%[2]，這些患者往往需要雙聯(lián)抗血小板治療(通常是阿司匹林聯(lián)合一種P2Y12受體抑制劑),以降低支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[3]。然而,近期TWILIGHT和TICO 2項(xiàng)大型研究結(jié)果證實(shí)，患者在接受3個(gè)月雙聯(lián)抗血小板治療后，使用替格瑞洛單藥治療的效果和安全性優(yōu)于12個(gè)月的雙抗標(biāo)準(zhǔn)療法[4-5]，可能預(yù)示著未來(lái)麻醉醫(yī)生將遇到更多正在接受替格瑞洛單藥治療的患者需要行急診手術(shù)或擇期手術(shù)的情況，這些患者在術(shù)前過(guò)早或過(guò)晚停止抗血小板治療將可能面臨圍術(shù)期嚴(yán)重的心臟缺血風(fēng)險(xiǎn)或手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)。Malm等[6]證明，接受替格瑞洛治療的患者在心臟手術(shù)術(shù)前行血小板功能測(cè)試，有助于預(yù)測(cè)圍術(shù)期發(fā)生嚴(yán)重出血的風(fēng)險(xiǎn)，而對(duì)于非心臟手術(shù)(如神經(jīng)外科、泌尿外科手術(shù))，基于血小板功能測(cè)試來(lái)確定P2Y12受體抑制劑停用時(shí)間尚有爭(zhēng)議。本研究將分析替格瑞洛單藥應(yīng)用對(duì)家兔血小板功能及手術(shù)出血量的影響及術(shù)前血小板功能與家兔手術(shù)出血量的相關(guān)性，探討血小板功能檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)圍術(shù)期替格瑞洛應(yīng)用的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年新西蘭家兔30只，體重2.0～2.5 kg，2～4月齡，雌雄不限，混合飼料，分籠喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)實(shí)施(2101151)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黔)2018-0001]。家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組(A組)、停藥組(B組)、不停藥組(C組)，每組10只。

1.2 藥品、試劑及儀器 替格瑞洛片(倍林達(dá)，90 mg×14片/盒，批號(hào)：J20171077，AstraZeneca AB公司)，戊巴比妥鈉(5 g/瓶，批號(hào)：922L035，北京索萊寶)，5%復(fù)方利多卡因乳膏(批號(hào)：10 g/支，批號(hào)：H20063466，清華同方)，二磷酸腺苷二鈉(ADP Na2，CAS:16178-48-6，北京索萊寶)，3 ml枸櫞酸鈉1∶9抗凝管(批號(hào)：0065398，美國(guó)碧迪公司)，3 ml EDTA-K2抗凝管(批號(hào)：0358744，美國(guó)碧迪公司)，Sonoclot?凝血和血小板功能分析儀(美國(guó)Sienco)，CHRONO-LOG 700血小板聚集儀(美國(guó)Chrono-log)，Mindray BC-5150 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞)。

1.3 給藥方法 指南推薦成人首次給予替格瑞洛負(fù)荷劑量 180 mg，維持劑量為90 mg/次，每天2次[7]。因此，可根據(jù)家兔與人之間藥物等效劑量換算公式[8]計(jì)算出家兔的用藥量。三組家兔均采用灌胃法給藥，生理鹽水對(duì)照第1天給予5 ml生理鹽水灌胃1次，從第2天開始改為2次/d，連續(xù)灌胃6 d。停藥組第1天給予9.0 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml藥液灌胃1次，從第2天開始給予4.5 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml藥液灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃3 d后改用生理鹽水5 ml灌胃3 d。停藥組第1天給予9.0 mg/kg替格瑞洛配置成的5 ml藥液灌胃1次，從第2天開始給予4.5 mg/kg替格瑞洛所配置成的5 ml藥液灌胃，2次/d，連續(xù)灌胃6 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 分別于給藥前、給藥第4天及第7天經(jīng)家兔耳中動(dòng)脈采血3次，每次5 ml，其中2.7 ml用于檢測(cè)血小板最大聚集率(Maximum platelet aggregation rate，MPAR)，0.5 ml用于Sonoclot?檢測(cè)血小板功能(Platelet function，PF)，1.8 ml用于血小板計(jì)數(shù)測(cè)定。于給藥第7天時(shí)，對(duì)家兔進(jìn)行腎臟皮質(zhì)切開手術(shù)，并記錄家兔的出血時(shí)間及手術(shù)出血量。

1.4.1 血小板最大聚集率檢測(cè) 家兔耳中動(dòng)脈血液2.7 ml加入3 ml枸櫞酸鈉1∶9抗凝采血管中，混勻后立即以800 r/min離心8 min取上清液制備富血小板血漿，剩余部分3 000 r/min 離心10 min后制備貧血小板血漿作調(diào)零備用。在雙通道Chrono-Log血小板聚集儀上通過(guò)光比濁法(ADP終濃度為5 μmol/L)測(cè)定曲線最高處的血小板聚集率(MPAR)。

1.4.2 血小板功能檢測(cè) 嚴(yán)格按照Sonoclot?凝血及血小板功能分析儀使用說(shuō)明將配套試杯及探針安裝至儀器上，室溫下向試杯中加入即時(shí)采集的兔血樣本360 μl，待儀器振蕩混勻后關(guān)閉儀器蓋子，開始自動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)試杯中凝血發(fā)生時(shí)血液黏滯度發(fā)生變化，分析儀通過(guò)傳感器感受凝血對(duì)振蕩探針低頻振蕩波的機(jī)械阻抗變化并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最后經(jīng)電腦處理計(jì)算出PF值。

1.4.3 血小板計(jì)數(shù)測(cè)定 室溫下將1.8 ml兔血緩慢加入EDTA-K2抗凝管中，輕輕混勻，通過(guò)Mindray全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.4 出血時(shí)間測(cè)定 在家兔灌胃第7天時(shí)，室溫下將家兔右側(cè)耳緣充分脫毛處理，予利多卡因乳膏充分表面麻醉后進(jìn)行消毒，用無(wú)菌手術(shù)剪在家兔右側(cè)耳緣做一個(gè)長(zhǎng)約0.5 cm的創(chuàng)口，創(chuàng)口均于耳緣中部垂直于耳緣剪開，使血液自然流出。創(chuàng)口開始流出血液時(shí)立即使用秒表計(jì)時(shí)，隨后每隔5 s用濾紙條輕觸血液，避免直接觸及或按壓切口，蘸取流出的血液，濾紙條上的血跡按時(shí)間順序排列，直至濾紙條上無(wú)新鮮血跡，計(jì)時(shí)結(jié)束。此時(shí)秒表上計(jì)時(shí)數(shù)即為出血時(shí)間。

1.4.5 手術(shù)出血量測(cè)定 家兔灌胃第7天時(shí)，由同一人員對(duì)家兔進(jìn)行腎臟皮質(zhì)切開手術(shù)。使用3%的戊巴比妥鈉以1.5 ml/kg從家兔耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，麻醉后修剪兔毛備皮，常規(guī)消毒鋪巾后，以左側(cè)肋脊角為標(biāo)志做左背部斜切口，從后腹膜逐層切開，充分暴露腎臟，用手術(shù)刀在腎臟外側(cè)緣皮質(zhì)正中劃一條長(zhǎng)約1.5 cm、深約0.3 cm的傷口，避免劃傷腎髓質(zhì)，在傷口中部縫合3針，待腎臟傷口無(wú)明顯血液滲出后逐層關(guān)腹。使用去皮稱重的無(wú)菌干棉球收集術(shù)中出血，電子天秤稱重后記錄出血量。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔服藥前后血小板計(jì)數(shù)比較 結(jié)果顯示，服藥前后各組家兔血小板計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組家兔服藥前后血小板計(jì)數(shù)比較(×109/L)

2.2 各組家兔服藥前后MPAR比較 服藥前各組MPAR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。第4天，停藥組和不停藥組的MPAR較生理鹽水對(duì)照組及服藥前明顯降低(P<0.05)；第7天，停藥組的MPAR與生理鹽水對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，不停藥組MPAR較生理鹽水對(duì)照組及服藥前明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組家兔服藥前后MPAR比較(%)

2.3 各組家兔服藥前后PF值比較 結(jié)果顯示，服藥前后各組家兔PF值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組家兔服藥前后PF值比較

2.4 各組家兔第7天時(shí)手術(shù)出血量及出血時(shí)間比較 結(jié)果顯示，第7天時(shí)，停藥組與生理鹽水對(duì)照組比較，手術(shù)出血量及出血時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不停藥組手術(shù)出血量與其余兩組比較均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不停藥組出血時(shí)間與其余兩組比較均明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組第7天手術(shù)出血量及出血時(shí)間比較注：#與生理鹽水對(duì)照組比較，P<0.05；*與停藥組比較，P<0.05

2.5 家兔最大血小板聚集率與手術(shù)出血量的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MPAR和手術(shù)出血量之間呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.623，P<0.05)，即MPAR越低，出血量越多。

3 討論

替格瑞洛是一種環(huán)戊三唑嘧啶類抗血小板聚集藥物，它是一種非前體藥物，不經(jīng)肝臟代謝即可與P2Y12受體可逆性結(jié)合，從而阻斷ADP途徑抑制的血小板聚集[9]。研究已經(jīng)證實(shí)，在我國(guó)人群中，攜帶CYP2C19功能缺失等位基因與較高的氯吡格雷耐藥性之間存在相關(guān)性[10]，而服用替格瑞洛相較氯吡格雷可以降低攜帶此類無(wú)效等位基因的患者發(fā)生缺血事件的風(fēng)險(xiǎn)[11]。因此，國(guó)內(nèi)外冠心病相關(guān)指南均推薦替格瑞洛為一線治療藥物。歐洲最新指南更是指出，除外無(wú)法獲取替格瑞洛或存在使用禁忌證的情況，其余情況均應(yīng)優(yōu)先使用替格瑞洛[12]。替格瑞洛給藥后血漿濃度在1.5～3 h內(nèi)達(dá)到峰值，2～3 d后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[13]，停藥后作用消失時(shí)間為3～5 d[14]。盡管歐洲指南及國(guó)內(nèi)指南都認(rèn)為行非心臟手術(shù)的患者術(shù)前3 d停用替格瑞洛即可[1,15]，但這種“一刀切”的停藥方案并未考慮到個(gè)體間停用抗血小板藥物后血小板恢復(fù)時(shí)間的差異，并且“東亞悖論”認(rèn)為，與西方患者相比，亞洲患者抗血小板治療后出血風(fēng)險(xiǎn)更高[16]，因此，對(duì)于亞洲患者，確定術(shù)前停止抗血小板治療的時(shí)間應(yīng)采取個(gè)體化治療方式。研究顯示，按替格瑞洛指南推薦，術(shù)前3 d停藥后，約25%患者停藥3 d時(shí)血小板功能恢復(fù)不完全，可能存在手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)，或許血小板功能檢測(cè)是用于確定手術(shù)時(shí)機(jī)的一個(gè)有價(jià)值的工具[17]。目前指南僅建議在心臟手術(shù)前使用血小板功能檢測(cè)方法幫助近期使用過(guò)P2Y12受體抑制劑的患者確定手術(shù)時(shí)機(jī)[15]，然而在非心臟手術(shù)中相關(guān)支持證據(jù)較少。

本研究結(jié)果顯示，服藥前后各組家兔的血小板數(shù)目并未發(fā)生顯著改變，表明替格瑞洛并不是通過(guò)影響血小板的數(shù)量而發(fā)揮抗血小板作用。在各組血小板計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異的情況下，服用替格瑞洛至藥物作用達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，家兔由ADP誘導(dǎo)的MPAR顯著下降，這主要是由于替格瑞洛通過(guò)與血小板P2Y12受體非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷了通過(guò)ADP途徑介導(dǎo)的血小板聚集。在第7天時(shí)，不停藥組出血時(shí)間顯著延長(zhǎng)，手術(shù)出血量顯著增多，這主要是由于該組家兔血小板聚集功能受到持續(xù)抑制作用，影響了生理性止血過(guò)程；而停藥組停用替格瑞洛3 d后，由于替格瑞洛與血小板可逆性結(jié)合的特性，體內(nèi)替格瑞洛經(jīng)代謝排出后血小板恢復(fù)正常功能，MPAR恢復(fù)至正常水平，出血時(shí)間和手術(shù)出血量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前經(jīng)光比濁法測(cè)定的血小板最大聚集率與手術(shù)中出血量存在相關(guān)性。Mahla等[18]在評(píng)估術(shù)前7 d內(nèi)應(yīng)用氯吡格雷患者的血小板反應(yīng)性與非心臟手術(shù)出血量相關(guān)性的研究中也得出了相似的結(jié)論。對(duì)于急診手術(shù)而言，術(shù)前要做到停用抗血小板藥物達(dá)到指南推薦時(shí)間較為困難，本研究結(jié)果表明，在術(shù)前行MPAR檢測(cè)將有助于術(shù)者預(yù)料手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)，從而提前做出應(yīng)對(duì)措施。然而，血小板的功能包括黏附、活化、聚集、釋放及血塊收縮等，僅依靠血小板聚集能力代表血小板功能較為片面，并且現(xiàn)有的檢測(cè)方法均為體外檢測(cè)，無(wú)法完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理止血過(guò)程。故僅以血小板聚集能力單一指標(biāo)預(yù)測(cè)外科手術(shù)出血量并指導(dǎo)術(shù)前替格瑞洛停藥時(shí)間還需大量研究予以驗(yàn)證。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)三組家兔在所有時(shí)間點(diǎn)上由Sonoclot?分析儀檢測(cè)出的PF值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其結(jié)果無(wú)法反映服用替格瑞洛后所抑制的血小板功能及停藥后血小板功能的恢復(fù)。原因可能是其試劑杯中的玻璃珠經(jīng)內(nèi)源性凝血途徑快速激活凝血酶原，其作用掩蓋了替格瑞洛經(jīng)ADP途徑所致的血小板抑制作用，故本研究未能得出PF值與手術(shù)出血量存在相關(guān)性的結(jié)論。

本研究為動(dòng)物模擬臨床實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證后方可推廣。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)僅驗(yàn)證了MPAR與手術(shù)出血量的相關(guān)性，未能提供家兔手術(shù)安全的MPAR治療窗，相關(guān)結(jié)論尚需進(jìn)一步研究。另一方面，光比濁法僅反映了血小板的聚集功能，有關(guān)血小板其他功能對(duì)手術(shù)出血量的影響仍是本課題組今后繼續(xù)研究的方向。

綜上所述，術(shù)前3 d停用替格瑞洛可使家兔血小板功能及出血時(shí)間恢復(fù)至正常水平且不增加手術(shù)出血量；由于MPAR與手術(shù)出血量之間存在良好的相關(guān)性，故在服用替格瑞洛的情況下行術(shù)前MPRA的測(cè)定對(duì)評(píng)估手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)有一定的幫助，但根據(jù)MPAR制定替格瑞洛術(shù)前停用時(shí)間仍需更多研究資料的支持。