右美托咪定減輕大鼠腎缺血再灌注的機(jī)制及致肝損傷中的作用研究

鹿文琪，李小緒

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 蚌埠 233000)

導(dǎo)致急性腎臟損傷的其中一個機(jī)制是腎臟缺血再灌注損傷(RIRI)。腎臟屬于高灌注臟器，因此對缺血非常敏感[1]，RIRI也是手術(shù)治療腎臟疾病過程中較常見的病理生理現(xiàn)象。在大多數(shù)情況下，RIRI不僅會損傷原位臟器，還可能引起遠(yuǎn)隔臟器的損傷，而肝臟做為人體內(nèi)最大的實質(zhì)性臟器，其血流量大，極易受到循環(huán)中有害物質(zhì)的影響而出現(xiàn)病理改變和功能損傷[2]。王切[3]等研究表明，RIRI發(fā)生后，肝臟也會遭受過氧化損傷。RIRI的發(fā)生過程涉及多種蛋白和因子，其中以白細(xì)胞介素(interleukin，IL)家族最為常見[4]。除此之外，有研究表明，高遷移率族蛋白 B1[5-6](high mobility group box 1 protein，HMGB1)、Toll 樣受體4[7-10](toll-like receptor 4，TLR4)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路都參與了RIRI的發(fā)生過程，并在其中起到了重要的作用[11-12]。并且，白細(xì)胞介素家族能夠與這些通路相互影響，加重RIRI。有研究人員發(fā)現(xiàn)，RIRI在一些臟器如腦、心、肝、腎等中的發(fā)展程度能夠被右美托咪定抑制[13]。但Dex在其中作用的機(jī)制還沒有定論。由此，本文主要研究由于RIRI導(dǎo)致的大鼠肝損傷通過Dex預(yù)處理后，其HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路受到的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫離心機(jī)(KH20R-Ⅱ，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司),Precisa 電子分析天平( LS220ASCS，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(DNRLumiBIS，DNR公司，以色列)，蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Trans-Blot Turbo，Bio-Rad公司，美國)。Dexmedetomidine(Dex，批號：181230BP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司),戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。全自動生化檢測儀(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。IL-6、IL-8、IL-12 和TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。TLR4試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)，HMGB1試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)，NF-κB試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)。

1.2 動物分組

SD大鼠(雄性，SPF級)60只，重量區(qū)間250～300 g，年齡8～10 w，購買時間為2020年6月，購買地點為天津醫(yī)科大學(xué)動物中心，使用許可證號：SYXK(津)2020-0012。按照隨機(jī)數(shù)字法對60只SD大鼠(雄性)進(jìn)行分組：假手術(shù)組(Sham組)、RIRI組和 Dex 預(yù)處理組(Dex使用劑量分別為12.5、25、50 μg/kg)，每組12 只。所有實驗動物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，實驗前12 h禁飲禁食。Sham組大鼠與RIRI 組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)，但不進(jìn)行腎蒂封閉處理。RIRI 組大鼠經(jīng)非創(chuàng)傷性血管鉗封閉雙腎蒂，導(dǎo)致其缺血，封閉45 min后開放腎蒂。Dex預(yù)處理各劑量組大鼠在手術(shù)前30 min分別腹腔注射12.5、25、50 μg/kg的Dex。手術(shù)結(jié)束后，以青霉素溶液(20萬U/mL)分次充分清洗術(shù)野，逐層縫合皮膚，最后肌注青霉素鈉(4萬U/只)避免術(shù)后感染，術(shù)后72 h內(nèi)將實驗動物進(jìn)行處死。在對動物進(jìn)行處死之前，給與所有的大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉將其麻醉，然后固定這些大鼠，分離它們的股靜脈并置管。

1.3 標(biāo)本采集

將各組大鼠于手術(shù)后12～24 h以3 mg/mL戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射充分麻醉后仰面固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒后，取股靜脈血離心后取上清液，一部分用全自動生化儀檢測AST、ALT、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)及尿酸(UA)含量，另一部分按試劑盒說明采用ELISA 法檢測IL-6、IL-8、IL-12 和TNF-α。隨后處死大鼠，取出肝臟和腎臟迅速放入-80 ℃中保存，用于后續(xù)實驗。

1.4 大鼠肝臟及血清生化指標(biāo)檢測

肝臟組織炎癥指標(biāo)檢測：取肝臟組織0.1 g，加入預(yù)冷的生理鹽水1 mL，制成10%勻漿，離心 (4 ℃，4000 r/min) 10 min,取上清液1.5 mL，按IL-6、IL-8、IL-12 和TNF-α試劑盒操作說明采用ELISA 法檢測。

1.5 組織蛋白印跡Western Blot法檢測HMGB1、TLR-4、NF-κB步驟

將大鼠的腎臟組織取出，并將其放在0.8 mL細(xì)胞裂解液之中，使用儀器超聲細(xì)胞破碎儀對該組織進(jìn)行低溫勻漿處理，條件為12 000 r/min，-14 ℃，離心時間為10 min。離心結(jié)束后，取產(chǎn)物的上清，放置于-80 ℃冰箱之中保存。吸取1 μL的蛋白質(zhì)溶液，通過BCA法對蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，在樣品中適當(dāng)?shù)奶砑蛹?xì)胞裂解液，使得上樣蛋白濃度能夠保持一致。在樣品中按4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，充分混勻后在95 ℃條件下5 min使蛋白質(zhì)變性。按一定的次序上樣，安排好己知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物，通過進(jìn)行SDS-PAGE電泳的方法來對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，在電泳結(jié)束之后，經(jīng)由蛋白轉(zhuǎn)移裝置來將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，這一操作按照常規(guī)的轉(zhuǎn)移蛋白的方法進(jìn)行。在該轉(zhuǎn)移操作結(jié)束后，加入TBST溶液進(jìn)行洗膜，在室溫條件下充分的搖動。洗膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜放入封閉液中，在室溫條件下?lián)u動。結(jié)束封閉后，放置硝酸纖維素膜于一塑料袋中加入一抗溶液(1∶1000，5%脫脂牛奶溶解在TBST中，兔抗人IkBα抗體、兔抗人NF-κB抗體)，加入溶液的體積為每平方厘米膜加0.1 mL，在4 ℃條件下過夜。加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗，洗膜后成像)，首先混勻然后裝入袋中，小心的去除袋子里所有的氣泡，最后用封膜機(jī)將開口封上，在4 ℃的環(huán)境里過夜。去除反應(yīng)液，使用TBST清洗3次，每次時間為10 min。清洗結(jié)束后，在膜上加入帶有熒光的二抗(1∶20 000，LI-COR Biosciences，5%脫脂牛奶溶解在TBST中，加HRP標(biāo)記抗兔二抗)，在室溫條件下輕輕振蕩1 h，然后取出膜，在PBS溶液之中洗膜，重復(fù)洗膜3次，每次時間是10 min。通過Odyssey Western Blot分析儀進(jìn)行讀片。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清腎功能指標(biāo)比較

與Sham組相比，RIRI組和Dex預(yù)處理各劑量組大鼠血清BUN、SCr及UA水平顯著增高(P<0.01)，表明大鼠缺血再灌注腎損傷模型成功。與Sham組相比，RIRI組和Dex預(yù)處理各劑量組大鼠血清ALT和AST水平顯著增高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與RIRI組相比，Dex預(yù)處理組隨著Dex劑量的增高ALT和AST水平逐漸下降，其中低劑量組下降不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，而中、高劑量組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1、圖1。

表1 右美托咪定對3組大鼠血清生化指標(biāo)的影響

Dex低、中、高劑量分別為12.5、25、50 μg/kg，*與Sham 組相比(P<0.01)；#與RIRI組相比(P<0.01)圖1 右美托咪定對3組大鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.2 各組大鼠肝組織與血清炎性指標(biāo)比較

與Sham組相比，RIRI組和Dex預(yù)處理各劑量組大鼠肝組織與血清 IL-6、IL-8和TNF-α水平顯著調(diào)高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與RIRI組大鼠相比，Dex預(yù)處理組隨著Dex劑量的增高 IL-6、IL-8和TNF-α逐漸下降，其中低劑量組下降不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，而中、高劑量組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2、圖2。

表2 右美托咪定對3組大鼠肝組織和血清炎癥因子水平影響的比較

Dex低、中、高劑量分別為12.5、25、50 μg/kg，*與Sham組相比(P<0.01)；#與RIRI組相比(P<0.01)圖2 右美托咪定對3組大鼠肝組織和血清炎癥因子水平影響的比較

2.3 不同組大鼠腎臟組織中HMGB1、TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)水平的比較

與Sham組相比，HMGB1、TLR-4和NF-κB的蛋白表達(dá)水平在RIRI組和DEX預(yù)處理組中顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相較于RIRI組，隨著Dex劑量逐漸增高，HMGB1、TLR-4、NF-κB的蛋白表達(dá)水平在Dex預(yù)處理組中逐漸下降，其中低劑量組下降趨勢不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，而中、高劑量組下降水平顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖3。

表3 不同組大鼠腎組織HMGB1、TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)水平

Dex低、中、高劑量分別為12.5、25、50 μg/kg，*與Sham組相比(P<0.01)；#與RIRI組相比(P<0.01)圖3 各組大鼠腎組織HMGB1、TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)水平的變化

3 討 論

RIRI是在發(fā)生缺血和再次灌注過程中的炎癥反應(yīng)事件[14]，指的是腎臟組織缺血之后恢復(fù)血液的灌注導(dǎo)致腎臟的功能得不到恢復(fù)，從而產(chǎn)生一系列的生理及病理反應(yīng)。在這一過程中，微血管通透性發(fā)生明顯改變，其通透性顯著增加，其原因主要是由于炎癥細(xì)胞的浸潤，組織間液增多，使得腎組織水腫、進(jìn)一步導(dǎo)致腎髓質(zhì)細(xì)胞功能紊亂及腎間質(zhì)和腎小管的變性[15-17]。而RIRI常是多臟器損傷中的關(guān)鍵的病理生理發(fā)展過程，研究報道，RIRI導(dǎo)致的多臟器損傷患者的死亡率高達(dá)50%～80%[18]。目前臨床工作中尚無切實有效的腎缺血再灌注損傷的治療策略，對其治療目前仍然依賴于藥物。然而，這些藥物的治療療效一直欠佳。腎臟缺血再灌注損傷常常伴隨其他器官尤其是肝臟器官的損傷及功能障礙，這是由于肝臟對于腎缺血再灌注引起的血液中促炎調(diào)節(jié)因子含量升高更加敏感。相關(guān)研究表明，在缺血再灌注的情況下IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥標(biāo)志物的水平會顯著升高[19-21]。本實驗的結(jié)果證實，檢測RIRI組大鼠血清中的IL-6、IL-8、TNF-α均明顯增高，這與既往報道的腎臟缺氧再灌注模型相一致，不僅如此，我們在肝臟組織中的檢測也得到了相同的結(jié)果，即RIRI組明顯高于假手術(shù)組，證明IL-6、IL-8、TNF-α作為炎癥因子在腎臟缺氧再灌注大鼠的肝臟損傷中發(fā)揮重要作用。在研究腎缺血再灌注損傷模型中是否有IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子浸潤的同時，本研究還檢測了大鼠血清ALT、AST水平，結(jié)果顯示：RIRI組大鼠血清ALT和AST水平顯著調(diào)高，表明腎缺血再灌注同時引起了大鼠肝功能損傷。

右美托咪定(Dex)是高效、高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，主要用于患者在麻醉時或機(jī)械通氣時的鎮(zhèn)靜，不僅不會對呼吸造成抑制，還具有抗焦慮和鎮(zhèn)痛作用，隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)Dex可減輕IRI[15,22]8580475-8580487，其發(fā)揮作用的方式主要是依賴于α2腎上腺素受體[23]。Dex能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡過程，對于炎癥反應(yīng)也有介導(dǎo)作用，同時還具有抗氧化等作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用Dex預(yù)處理腎缺氧再灌注損傷大鼠模型后，與RIRI組大鼠相比，Dex預(yù)處理各劑量組大鼠ALT和AST水平隨著使用劑量的增多有逐漸下降的趨勢，以中高劑量組下降最為明顯，提示Dex預(yù)處理可減輕大鼠肝功能損傷，對IRI引起肝損傷有保護(hù)作用。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)，與RIRI組大鼠相比，Dex預(yù)處理各劑量組大鼠炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8及TNF-α水平均隨著使用劑量的增多逐漸下降，表明Dex預(yù)處理明顯還可抑制炎癥介質(zhì)相關(guān)因子的表達(dá)，減輕大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)。但是，目前關(guān)于Dex保護(hù)受到RIRI損傷臟器的具體作用機(jī)制仍舊缺少相關(guān)研究報道。研究表明HMGB1/TLR4/NF-κB通路在心肌IRI過程中被激活，并導(dǎo)致各種炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)，是組織發(fā)生損傷的重要機(jī)制[24]。本研究各組大鼠腎組織HMGB1、TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)量顯示：與Sham組相比，RIRI組大鼠腎組織HMGB1、TLR-4和NF-κB表達(dá)水平顯著調(diào)高，提示RIRI中HMGB1/TLR4/NF-κB信號軸也被激活，與RIRI組大鼠相比，Dex預(yù)處理各劑量組大鼠腎組織HMGB1、TLR-4和NF-κB水平均下降，同樣，以中高劑量組下降最為明顯。提示Dex減輕RIRI的作用機(jī)制可能與抑制了 HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路的傳導(dǎo)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Dex可能通過抑制或減少 HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮抗炎作用，使腎缺血再灌注所致的肝損傷有所減輕。