鮮艷乳菇母種培養(yǎng)基的配方優(yōu)化研究

鄭 旋， 康 超， 王 晶， 曾維軍， 王萬坤， 楊彝華， 向 準

(貴州省生物研究所， 貴陽 550009)

鮮艷乳菇(Lactariusvividus)隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agricomycetes)、紅菇科(Russulaceae)、乳菇屬(Lactarius)，在世界各地均有分布，是新發(fā)現(xiàn)的模式產(chǎn)地在中國的新物種，廣泛分布于中國中部、西南及華南地區(qū)[1]。鮮艷乳菇為外生菌根真菌(ECM)，與松科、殼斗科等樹種形成外生菌根[2]。其菌蓋橙黃色，傷變藍綠色，味道鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等營養(yǎng)成分[3]，市場上售賣的鮮艷乳菇主要依賴于野生子實體采集，隨著生長環(huán)境受人為及自然因素影響，野生鮮艷乳菇數(shù)量逐年下降，鮮艷乳菇人工栽培成為發(fā)展趨勢，而鮮艷乳菇菌種培養(yǎng)是發(fā)展人工栽培的基礎(chǔ)[4]。趙輝等[5]采集達州地區(qū)鮮艷乳菇進行分離培養(yǎng)，徐彥軍[6]研究了鮮艷乳菇在母種、原種及液體種培養(yǎng)基上的菌絲特性，結(jié)果均顯示，由于培養(yǎng)基組成成分不同，對鮮艷乳菇菌絲生長產(chǎn)生不同影響。本研究采用單因素及正交試驗法，對鮮艷乳菇在不同氮源、碳源、無機鹽培養(yǎng)下的菌絲生長速度、菌絲萌發(fā)、菌絲形態(tài)等進行測定，通過優(yōu)化母種培養(yǎng)基配方，促進菌絲萌發(fā)與生長，為鮮艷乳菇菌種培育和人工馴化栽培提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：于2020年6月6日在貴州省龍里縣市場收集的鮮艷乳菇子實體進行分離培養(yǎng)及鑒定保存。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏、尿素、氯化銨、硫酸銨、草酸銨，葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、甘露醇、糊精、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、CaCl2、NaCl、NaOH、HCl，以上試劑均為分析純或生化試劑。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL。

蛋白胨麥芽糖培養(yǎng)基：大豆蛋白胨5 g、麥芽糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種活化

挑取保存的鮮艷乳菇試管菌株，接種到PDA培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，待菌絲生長20 d，備用。

1.2.2單因素試驗

配置不同組成成分的試驗培養(yǎng)基，挑取活化的鮮艷乳菇菌種塊接種于不同培養(yǎng)基中央，每個處理重復3次，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)30 d，每隔5 d觀測菌絲疏密度、長勢，顏色、菌落直徑、菌絲生長速度等指標。

氮源篩選：以葡萄糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量均為5 g的蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏、尿素、氯化銨、硫酸銨、草酸銨，以該基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組(ck1)。

組合氮源篩選：將篩選出的適宜氮源，酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉浸粉，進行“兩兩組合”試驗。在葡萄糖20 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加總質(zhì)量為5 g的組合氮源，每個組合設置5個不同質(zhì)量比，質(zhì)量比分別為1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。

碳源篩選：以馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量均為20 g的葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、甘露醇、糊精，以該基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為(ck2)。

組合碳源篩選：將篩選出的適宜碳源，葡萄糖、麥芽糖、糊精，進行“兩兩組合”試驗。在馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、純凈水1 000 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加總質(zhì)量為5 g的組合氮源，每個組合設置5個不同質(zhì)量比，質(zhì)量比分別為1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。

無機鹽單因素篩選：以大豆蛋白胨麥芽糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加相同質(zhì)量為0.5 g的KH2PO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、CaCl2、NaCl，以該基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為(ck3)。

1.2.3正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素篩選及組合復篩試驗結(jié)果，以組合氮源、單一碳源、單一無機鹽為主要影響因素，采用L9(34)正交表，設置酵母浸粉+牛肉浸粉(質(zhì)量比=7∶3)，葡萄糖，CaCl2的3因素3水平正交試驗，對培養(yǎng)基配方進一步優(yōu)化(見表1)。

表1 L9(34)正交試驗設計因素

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對鮮艷乳菇菌絲生長的影響

在鮮艷乳菇母種培養(yǎng)基中添加不同氮源對菌絲生長的影響如表2所示。不同氮源對菌絲直徑與生長速度影響呈現(xiàn)顯著差異性，以大豆蛋白胨為氮源培養(yǎng)基，菌絲生長速度最快，為2.35 mm/d，酵母浸粉次之，為1.52 mm/d，尿素和草酸銨培養(yǎng)下菌絲無生長。從萌發(fā)時間來看，在蛋白胨和大豆蛋白胨的氮源培養(yǎng)基，菌絲萌發(fā)時間最快，其次是酵母浸粉和酵母膏。從菌絲疏密度來看，以牛肉浸粉為氮源培養(yǎng)下，菌絲最密，其次是酵母浸粉和牛肉浸膏，而大豆蛋白胨培養(yǎng)下菌絲密度較稀。結(jié)合菌絲生長速度、萌發(fā)時間、菌絲疏密度和菌絲形態(tài)等指標，鮮艷乳菇菌絲生長的最優(yōu)氮源為酵母浸粉和牛肉浸粉。

表2 不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生長情況

2.2 不同氮源組合對鮮艷乳菇菌絲的影響

如圖1、圖2所示。在酵母浸粉與大豆蛋白胨組合中，當質(zhì)量比為1∶9時菌絲生長速度最快，差異顯著，但菌絲密度稀疏。在酵母浸粉與牛肉浸粉組合中，隨著酵母浸粉的比重增加，菌絲生長速度基本呈向上趨勢，當質(zhì)量比為7∶3時菌絲生長速度最快，菌絲均較為致密。在大豆蛋白胨與牛肉浸粉組合中，當牛肉浸粉占比大時菌絲生長速度較慢，菌絲較密?？紤]菌絲生長速度和菌絲密度，優(yōu)選氮源組合為酵母浸粉與牛肉浸粉組合(質(zhì)量比為7∶3)，即培養(yǎng)基中添加酵母浸粉3.5 g/L，牛肉浸粉1.5 g/L。

圖1 不同氮源組合培養(yǎng)基上的菌絲生長速度

注：A組為酵母浸粉與大豆蛋白胨組合，B組為酵母浸粉與牛肉浸粉組合，C組為大豆蛋白胨與牛肉浸粉組合；其中數(shù)字1～5分別表示質(zhì)量比為1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。圖2 不同氮源組合培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.3 不同碳源對鮮艷乳菇菌絲生長的影響

在培養(yǎng)基中添加不同碳源對鮮艷乳菇菌絲生長的影響見表3所示。不同碳源對菌絲直徑與生長速度影響呈顯著差異性，以麥芽糖為碳源培養(yǎng)基，菌絲生長速度最快，為2.15 mm/d，其次是糊精和葡萄糖，木糖和半乳糖培養(yǎng)下菌絲未萌發(fā)生長。從萌發(fā)時間來看，在以麥芽糖、糊精和葡萄糖的培養(yǎng)基上菌絲萌發(fā)時間最快，其次是蔗糖和甘露醇。從菌絲疏密度來看，葡萄糖培養(yǎng)下菌絲密度最大，果糖次之。從菌絲形態(tài)來看，葡萄糖、果糖、甘露醇呈現(xiàn)針尖狀，其他均呈現(xiàn)放射狀。結(jié)合以上多個指標，鮮艷乳菇菌絲生長的最優(yōu)碳源為葡萄糖。

表3 不同碳源對鮮艷乳菇菌絲生長的影響

2.4 不同碳源組合鮮艷乳菇菌絲生長的影響

不同碳源組合對鮮艷乳菇菌絲生長的影響見圖3、圖4所示?？梢钥闯?，隨著質(zhì)量比的變化，不同碳源組合培養(yǎng)下菌絲生長速度基本呈由快到慢再變快的趨勢，在質(zhì)量比為3∶7時菌絲生長速度均較慢。當麥芽糖和糊精的組合質(zhì)量比為7∶3時，以及麥芽糖與葡萄糖的質(zhì)量比也為7∶3時，菌絲生長速度相對較快，為1.91 mm/d和1.92 mm/d。但從落形態(tài)及菌絲疏密度來看，不同碳源組合培養(yǎng)基上菌落顏色較深，菌絲稀疏，貼附生長，鮮艷乳菇菌絲在單一碳源培養(yǎng)下優(yōu)于組合碳源，故選用葡萄糖為單一碳源，不選擇組合碳源。

圖3 不同碳源組合培養(yǎng)基上的菌絲生長速度

注：a組為麥芽糖與糊精組合，b組為麥芽糖與葡萄糖組合，c組為糊精與葡萄糖組合；其中數(shù)字1～5分別表示質(zhì)量比為1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。圖4 不同碳源組合培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.5 不同無機鹽對鮮艷乳菇菌絲生長的影響

在培養(yǎng)基中添加不同無機鹽對鮮艷乳菇菌絲生長的影響，見圖5所示。添加不同無機鹽及對照組的菌落平均直徑大小順序為CaCl2>MgSO4>KH2PO4>ck>NaCl>FeSO4>CuSO4>MnSO4=ZnSO4，其中CaCl2對菌絲生長表現(xiàn)出顯著促進作用，菌落直徑為64.72 mm。其次，是在添加MgSO4培養(yǎng)下，菌落平均直徑為55.02 mm，以及添加KH2PO4培養(yǎng)下，菌落平均直徑為53.87 mm，但均與ck3數(shù)據(jù)無顯著差異，而在添加MnSO4和ZnSO4的培養(yǎng)基上菌絲未萌發(fā)生長，故選擇CaCl2作為鮮艷乳菇培養(yǎng)基中的無機鹽。

注：不同小寫字母表示在p<0.05水平下差異顯著。圖5 添加不同無機鹽的培養(yǎng)基中的菌落直徑

2.6 正交試驗結(jié)果

L9(34)正交試驗結(jié)果直觀分析結(jié)果，從表4可以看出，3個試驗因素對菌絲生長速度的影響為C>B>A。由表5可知，各因素之間無顯著差異性。按照各因素的最優(yōu)水平，C3B2A2水平組合為最優(yōu)組合。結(jié)合Design-Expert軟件分析，對C3B2A2組合進行驗證。

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果及直觀分析

表5 正交試驗方差分析

驗證結(jié)果為，C3B2A2培養(yǎng)基上菌絲生長速度為2.18 mm/d，與軟件預測結(jié)果的2.21 mm/d數(shù)據(jù)相近，故選擇C3B2A2為最優(yōu)組合，即酵母浸粉3.5 g/L、牛肉浸粉1.5 g/L、葡萄糖20 g/L、CaCl21.5 g/L。

3 討論與結(jié)論

本研究通過結(jié)合單因素及多因素組合試驗，分析了不同因素對鮮艷乳菇菌絲生長速度、菌落直徑、菌絲疏密度等的影響，篩選出適宜鮮艷乳菇菌絲生長的氮源、碳源和無機鹽，采用正交試驗對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)選出鮮艷乳菇最適母種培養(yǎng)基配方。研究發(fā)現(xiàn)，在不同氮源中，酵母浸粉、牛肉浸粉和大豆蛋白胨對菌絲生長有較好的促進作用，尿素和草酸銨對菌絲生長產(chǎn)生明顯抑制作用。其中大豆蛋白胨能顯著促進菌絲快速生長，但菌絲密度低，牛肉浸粉能增強菌絲密度，但菌絲快速延生能力較弱，酵母浸粉在促進菌絲生長和增強菌絲密度兩方面均處于中等效果，比較穩(wěn)定。當酵母浸粉和牛肉浸粉的質(zhì)量比為7∶3時，菌絲密度和生長速度達到較優(yōu)水平，菌絲活力高。該研究結(jié)果與趙輝等[5]研究得到適宜氮源為酵母膏和蛋白胨，以及王冉等[7]研究得出添加酵母提取物的MYA為適宜培養(yǎng)基，在關(guān)于適宜氮源包含酵母的這一結(jié)論有一定相似。不同的是，本研究結(jié)果顯示出酵母浸粉與牛肉浸粉(質(zhì)量比7∶3)的組合氮源優(yōu)于單一氮源，這可能是由于鮮艷乳菇菌絲能夠較好地吸收不同來源的氮源營養(yǎng)物質(zhì)，以供給自身生長。在不同碳源培養(yǎng)中，麥芽糖、糊精和葡萄糖對菌絲生長有較好的促進作用，木糖和半乳糖無法被菌絲吸收利用，其中葡萄糖能被菌絲較好吸收利用，菌絲較密，生長速度也較快，而通過不同碳源組合的試驗效果不如單一碳源效果好，這可能是由于鮮艷乳菇菌絲在生長過程中對碳源具有相對選擇性。研究結(jié)果與劉萍等[8]得出以馬鈴薯為碳源的結(jié)論有一定差異，而與趙輝等[5]研究得到適宜碳源為葡萄糖的結(jié)論相同。在不同無機鹽中，CaCl2較其他無機鹽對菌絲生長的促進作用最顯著，但本研究中缺少了對不同無機鹽不同添加量的試驗設置，只選擇了較為普遍的添加量，這可能不利于某些微量元素的影響判斷，需要做進一步優(yōu)化。本研究通過將篩選出的氮源、碳源、無機鹽進行3因素3水平的正交試驗，得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為酵母浸粉3.5 g/L、牛肉浸粉1.5 g/L、葡萄糖20 g/L、CaCl21.5 g/L，瓊脂18～20 g/L。后期將嘗試研究更多其他因素對鮮艷乳菇菌絲生長的影響，以及液體菌種培養(yǎng)基的研究，為鮮艷乳菇菌種培育、保存和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。