鼠傷寒沙門菌sapC基因缺失株的構建及生物學特性分析

曹 莉，程如楠，武周慧，王家偉，王 瑜，張永紅，吳清民，王 真*

(1.北京農學院動物科學技術學院，獸醫(yī)學(中獸醫(yī))北京市重點實驗室，北京 102206；2. 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193； 3.北京大學第三醫(yī)院實驗動物中心，北京 100191)

沙門菌病()是由沙門菌感染引起的人與多種動物共患的傳染病，對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的危害。此外，由于人群感染率的不斷上升也使得沙門菌病成為影響全球的公共衛(wèi)生問題。由于O和H抗原的多樣性導致沙門菌擁有豐富的血清型，目前已經超過2 600余種。腸道沙門菌腸道亞種中的鼠傷寒沙門菌(Typhimurium)和腸炎沙門菌(Enteritidis)是引起人畜沙門菌病的兩大血清型。鼠傷寒沙門菌是引起食源性疾病最常見血清型，可導致人的急性胃腸炎，且能夠引起小鼠發(fā)生全身傷寒性疾病。據文獻記載，沙門菌導致的食物中毒約占58.05%，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌各分別21.59%和16.81%。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)廣泛分布于動物體內各種黏液和腸道黏液中，在病原入侵時可以被誘導表達，對細菌、病毒、真菌等微生物具有殺滅的作用。據報道，AMPs對抵抗沙門菌在巨噬細胞內生存、胃腸道持續(xù)定殖以及感染也有著至關重要的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，由ABCDF操縱子編碼的(ABC)轉運蛋白與沙門菌的毒力相關。ABC轉運蛋白在真核和原核生物細胞中廣泛存在，底物是離子、氨基酸、多糖、多肽等物質，許多細菌ABC轉運蛋白被證實與細菌耐藥性有關。為了進一步研究沙門菌轉運蛋白SapC的生物學功能，本研究使用λ-同源重組技術構建鼠傷寒沙門菌基因缺失株；對基因缺失株的生長特性、多黏菌素B敏感性、酸敏感性、生物被膜形成能力、胞內增殖以及小鼠體內毒力進行研究，系統(tǒng)分析了基因的功能，為闡釋沙門菌致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

鼠傷寒沙門菌Typhimurium ATCC 14028s，質粒pKD46、pKD3、pCP20及互補質粒pBR322均由本實驗室保存；鼠源巨噬細胞J774A.1，由中國農業(yè)大學吳清民教授實驗室饋贈；BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司；PCR Mixture、T4 連接酶、DNA Marker、限制性內切酶、凝膠回收試劑盒等均購自北京擎科生物技術有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據鼠傷寒沙門菌基因組序列，借助Primer 5.0 設計3對引物。引物F1、F2由兩部分組成，劃線部分用于定位序列，未劃線部分與氯霉素抗性基因()同源，最終擴增出帶有同源臂的氯霉素抗性序列。引物F3、F4與基因同源且位于F1、F2外側，用于缺失基因的鑒定。引物F5、F6用于基因擴增和互補菌株構建。上述引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴增所用引物Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.3 沙門菌sapC基因缺失株及互補株的構建

使用引物F1和F2 擴增質粒pKD3上的氯霉素基因片段，膠回收后溶于ddHO中；將攜帶有pKD46的Typhimurium ATCC 14028s培養(yǎng)至OD0.4～0.6時加入阿拉伯糖使其終濃度為30 mmol·L， 30 ℃誘導1 h后冰浴30 min，并用預冷的去離子水洗滌3 次，最后將獲得的感受態(tài)細胞溶于去離子水。將帶有同源臂的氯霉素基因電擊轉化入上步所得感受態(tài)細胞中，復蘇后涂于氯霉素平板，培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)2 h，經PCR鑒定為陽性的菌液于42 ℃消除熱敏質粒pKD46，最后通過氨芐抗性平板篩選和PCR鑒定獲得一次重組菌株。將質粒pCP20電轉進一次重組菌株中，用以消除氯霉素基因，同樣經熱激消除質粒，再次篩選后獲得基因缺失菌株，并進行PCR鑒定。

利用質粒pBR322構建克隆載體，繼而電轉到菌株中，經PCR鑒定為陽性的菌株命名為::，即為互補菌株。

1.4 重組菌生長特性觀察

為測定、和::三種沙門菌株的生長特征，取單菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min震蕩培養(yǎng)，在第2、4、6、8、10、12 h分別取樣檢測OD值，繪制3種菌株的生長曲線。

1.5 重組菌對多黏菌素B敏感性試驗

挑取、和::單菌落接種于10 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD=0.4～0.6，4 ℃保存?zhèn)溆?。將各菌液稀釋?0CFU·mL， 取100 μL加入到96孔板中，并加入100 μL 0.3 μg·mL的多黏菌素B，混勻后，放入37 ℃恒溫箱孵育1 h后計數(shù)，計算各菌株的存活率。

1.6 重組菌酸敏感性試驗

使用生理鹽水調整、和::菌液濃度為 1×10CFU·mL；各菌液平均分成兩管，其中一管離心后，加入新鮮的LPM培養(yǎng)基(pH為3)重懸菌體，放置37 ℃恒溫箱1 h后取出計數(shù)；另一管離心后先加入pH為5.5的LPM培養(yǎng)基適應1 h，離心后再加入pH為3的LPM培養(yǎng)基，放置37 ℃恒溫箱1 h后取出計數(shù)，分析各菌株存活率。

1.7 重組菌生物被膜形成能力檢測

取、和::菌液以1%接入TSB液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)至OD=0.5，以200 μL·孔加入96 孔板中，置于37 ℃ 48 h后棄去菌液，PBS洗滌3次，加入200 μL甲醇固定15 min 后棄去上清，用0.1%結晶紫室溫染色5 min后沖洗；再加33%冰醋酸溶解結晶紫，測量OD值，根據ODc臨界值判定生物被膜黏附強度，ODc為OD平均值加3倍標準差，OD≤ODc為不黏附，ODc4ODc為強黏附。

1.8 重組菌胞內存活能力的測定

將生長狀態(tài)良好的鼠源巨噬細胞J774A.1，以1×10·孔鋪于24 孔板；用培養(yǎng)至OD0.4～0.6的、和::細菌以MOI=10感染J774A.1細胞，孵育1 h后棄上清，加入含20 μg·mL慶大霉素的DMEM殺死游離的細菌。分別在感染后1、4、8、12、16、24 h加入1% Tritoxn-100，并對釋放出的細菌平板計數(shù)，繪制各菌株在胞內的增殖曲線。

1.9 小鼠體內毒力測定

沙門菌為胞內寄生病原菌，在機體內增殖存留時間及臟器載菌量，是評價毒力的重要指標。購買20只BALB/c小鼠，每組10只，分別以10劑量腹腔注射、菌液，逐日觀察記錄小鼠死亡日期和數(shù)量。接種后7 d，剖殺組3只小鼠，同對照組第7日死亡的小鼠，分別進行脾和肝的載菌量測定。

2 結 果

2.1 sapC基因缺失株和互補菌株的構建與鑒定

使用同源臂引物F1、F2，擴增質粒pKD3中的氯霉素基因序列，并電轉進攜帶質粒pKD46的親本菌中，經熱激消除質粒pKD46；再電轉入質粒pCP20 敲除氯霉素基因，獲得重組菌株，PCR 鑒定結果如圖1，基因缺失株擴增條帶為160 bp，擴增條帶為891 bp，互補菌株擴增出兩條目的條帶(160和891 bp)，與預期相符，表明成功構建了基因缺失菌株和互補菌株。

M.DL5000；1.sapC基因缺失株；2.親本菌株；3.互補菌株M.DL5000: 1.sapC gene deleted strain;2.Wild strain; 3. Supplemented strain圖1 重組菌的PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant strains by PCR

2.2 重組菌生長特性觀察

取LB中培養(yǎng)不同時間的、和C::菌液測定OD，繪制生長曲線。結果如圖2所示，各菌株總體生長無明顯差異，說明基因不影響沙門菌的生長。

圖2 基因缺失株SM△sapC、互補菌株SM△sapC::sapC與親本株SM的生長特性Fig.2 Growth culves of SM△sapC,SM and SM△sapC::sapC

2.3 重組菌多黏菌素B敏感性測定

使用終濃度為0.15 μg·mL多黏菌素B作用各菌株1 h后，活菌計數(shù)。結果如圖3所示，在多黏菌素B作用下基因缺失株可以正常增殖，且活菌數(shù)與親本菌株相比差異顯著。說明基因對鼠傷寒沙門菌的多黏菌素B耐受性起到負調控作用。

與SM組相比，*.P<0.05Compared with SM group, *. P<0.05圖3 重組菌多黏菌素B敏感性試驗結果Fig.3 Polymyxin B sensitivity test of recombinant strains

2.4 重組菌酸性敏感性測定

將各重組菌進行酸適應和酸性未適應兩種處理。酸適應是將各菌株首先暴露于pH為5.5的LPM液體培養(yǎng)基，然后暴露于pH為3的LPM液體培養(yǎng)基中；酸性未適應是在相同條件下將各菌液在原培養(yǎng)基培養(yǎng)后直接暴露于pH為3的LPM培養(yǎng)基。兩種情況下分別計算存活率。結果如圖4所示，在酸適應情況下，的存活率為40%左右，與相比差異顯著；在酸性未適應情況下，的存活率僅為6%左右，與相比差異極顯著，互補株酸耐受能力得到回復。由此表明基因的缺失可以明顯降低鼠傷寒沙門菌的耐酸能力。

A.酸適應處理(經pH5.5過渡至pH3培養(yǎng))；B.酸性未適應處理(直接入pH3培養(yǎng))。與SM組相比,*. P<0.05；***. P<0.001A. Acid adaptation (with pH transition from 5.5 to 3); B.Acid inadaptation (directly cultured at pH 3). Compared with SM group, *. P<0.05; ***. P<0.001圖4 重組菌酸敏感性試驗結果Fig.4 Acid sensitivity test results of recombinant strains

2.5 重組菌生物被膜形成能力分析

借助結晶紫染色法定量分析菌株、和::的生物被膜形成能力，結果表明，親本菌株和::為強黏附，為弱黏附，基因缺失菌株的生物被膜形成量僅為親本菌株的30%(圖5)。表明基因參與沙門菌的生物被膜形成。

與對照組相比,*. P<0.05；**. P<0.01Compared with the control group, *. P<0.05; **. P<0.01圖5 重組菌生物被膜形成能力分析Fig.5 Analysis of biofilm formation abilities of recombinant strains

2.6 重組菌的胞內存活能力測定結果

將各菌株以MOI=10感染巨噬細胞，并在不同時間點取樣，對胞內沙門菌平板計數(shù)。結果如圖6所示，胞內增殖能力顯著低于親本菌株；在感染后的1和 24 h，基因缺失菌株的胞內載菌量降低了約10倍，互補株的胞內定殖能力回復。表明能夠降低沙門菌的胞內存活能力。

與SM組相比,*. P<0.05；**. P<0.01Compared with SM group, *. P<0.05; **. P<0.01圖6 重組菌胞內增殖能力測定結果Fig.6 Intracellular viability tests of recombinant strains

2.7 小鼠體內毒力試驗結果

取親本菌株和基因缺失菌株，進行小鼠試驗，感染后連續(xù)記錄小鼠死亡數(shù)量。如圖7所示，接種的小鼠在12 d內全部死亡，而接種的小鼠16 d內的存活率為100%(注：接種組，第7日剖殺3只小鼠，用于臟器載菌量測定)；接種7 d時，組小鼠脾載菌量比組小鼠載菌量低近2個數(shù)量級(圖8)。表明基因的缺失降低了沙門菌的毒力。

圖7 小鼠死亡曲線Fig.7 Survival curves of mice

與SM組相比,*. P<0.05Compared with SM group, *. P<0.05圖8 重組菌小鼠體內載菌量測定Fig.8 Bacterial loads in mice spleen and liver of recombinant strains

3 討 論

作為兼性胞內寄生菌，沙門菌可通過生成內噬體的形式保護其在細胞內的增殖和游走。沙門菌能引起多種動物發(fā)病，導致宿主局部和全身感染，還能導致隱性和持續(xù)性感染，這給該病的防治帶來很大難度。基因工程的方法能弱化菌株毒力的同時保持較好的侵襲力，這為沙門菌病的防控提供了方向。因此研究沙門菌的致病機制，可為沙門菌病提供可能的防控策略。本文對鼠傷寒沙門菌ABC轉運膜蛋白SapC與其毒力的關系進行研究，探索該蛋白在沙門菌致病中的作用，為沙門菌病新型疫苗的研究奠定基礎。

為了分析基因的生物學功能，本研究利用 Red 同源重組技術構建了基因缺失菌株。結果發(fā)現(xiàn)，多黏菌素B刺激下，缺失株的活菌數(shù)較親本菌株增加，說明對鼠傷寒沙門菌抗菌肽耐受起到負調控作用。但其酸性耐受能力、生物被膜形成能力較親本菌株顯著降低。細胞感染試驗和小鼠體內毒力試驗更加說明了基因缺失菌株的胞內存活能力及其毒力均有所降低，推測參與鼠傷寒沙門菌的致病過程。

生物被膜(biofilm，BF)是由細菌在生長過程中分泌的多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白、DNA 等將菌體包裹形成的大量細菌聚集膜樣物。BF是幫助病原菌抵御外來藥物和宿主免疫系統(tǒng)殺傷的有效物理屏障，對細菌的存活具有重要意義。沙門菌在生長和感染過程中也能在多種附著物表面產生BF，這是細菌能在惡劣環(huán)境下生存甚至導致持續(xù)感染的一方面原因。本研究發(fā)現(xiàn)基因缺失能夠抑制鼠傷寒沙門菌BF的形成。

沙門菌在胞內最常見的惡劣條件之一是酸脅迫，因此感知和響應酸脅迫的能力對其生存至關重要。沙門菌通過復雜的酸存活系統(tǒng)響應酸性pH變化，統(tǒng)稱為耐酸反應(ATR)。當鼠傷寒沙門菌在亞致死pH(pH 4.5～5.5)下體外生長一代后，沙門菌便獲得在極端酸性條件下(pH 3)存活的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在酸適應情況下，下的存活率為40%左右，與相比差異顯著；在酸性未適應情況下，的存活率僅為6%左右，與相比差異極顯著，由此表明SapC能顯著降低鼠傷寒沙門菌在酸性環(huán)境中的存活能力。體內毒力試驗顯示，注射鼠傷寒沙門菌親本株的小鼠在12 d內全部死亡，而注射基因缺失株△的小鼠存活率為100%。此外，注射基因缺失菌株的小鼠肝和脾的細菌載量都明顯低于親本菌株。

4 結 論

利用Red 同源重組技術構建了Typhimurium基因缺失菌株和互補株::，對其生物學功能進行了研究。結果表明，基因缺失不影響沙門菌的正常生長，但能顯著降低其酸性耐受能力、生物被膜形成能力，并能降低鼠傷寒沙門菌胞內存活能力及毒力。綜上所述，基因與鼠傷寒沙門菌的致病性密切相關，有望作為新型弱毒疫苗研究的候選因子。