NR1H3基因調(diào)控豬前體脂肪細胞分化的研究

史明月，張雪蓮，楊曉奮，牛 瑾，邢建東，路 暢，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801； 2.晉城市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，晉城 048000)

動物體脂肪的合成與沉積對于胴體品質(zhì)有重要影響，脂肪組織的合成需要經(jīng)過前體脂肪細胞數(shù)目、體積的增加，細胞的融合分化等過程。其中脂肪細胞的分化受到多條信號通路調(diào)控，每條通路都包含多種轉(zhuǎn)錄因子，通過各種途徑調(diào)控脂肪細胞的分化。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)家族、脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein, FABP)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(CCAAT /enhancer binding protein, C/EBP)、類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)等均為公認的與脂肪形成相關的轉(zhuǎn)錄因子，其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是最熟知的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)也是與脂肪合成相關的轉(zhuǎn)錄因子，還能調(diào)控脂肪細胞的分化，對于脂質(zhì)代謝和葡萄糖轉(zhuǎn)運也有重要意義。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)主要參與脂肪酸的合成代謝，通過調(diào)節(jié)甘油三酯的含量影響動物機體脂質(zhì)的沉積。

肝X受體(liver X receptors，LXRs)屬于核受體超家族成員，受氧化型膽固醇調(diào)節(jié)，在脂質(zhì)代謝中是一個不可缺少的調(diào)節(jié)因子。核受體亞家族1H成員3(nuclear receptor subfamily 1 group H member 3，NR1H3)屬于LXRs的一員，也稱肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)，在人和多種動物組織中廣泛表達，在肝、腎中的表達量較多，主要作為膽固醇的感受器，通過調(diào)控下游基因來影響膽固醇的合成與轉(zhuǎn)化。此外，1H3在碳水化合物、脂蛋白代謝等方面也發(fā)揮重要作用。敲除1H3的小鼠血脂含量偏低，脂肪酸和甘油三酯的表達受到影響，脂肪形成能力減弱，證明1H3參與到小鼠的成脂過程，對于脂質(zhì)代謝過程的穩(wěn)定運轉(zhuǎn)具有重要意義。1H3在鴨原代肝細胞中過表達后，高密度脂蛋白和三酰甘油表達量增加。在脂肪肝細胞中敲低1H3后，三酰甘油含量降低，脂肪酸的合成過程受到影響。這都說明1H3對于脂質(zhì)合成、脂質(zhì)代謝、脂肪沉積等過程具有重要意義。

目前，有關1H3基因在脂肪細胞脂質(zhì)積累中作用的研究主要集中在小鼠和山羊等物種中，其對豬脂肪細胞中脂質(zhì)積累的調(diào)控作用研究較少。本研究在探究1H3基因在豬皮下脂肪組織中的發(fā)育性表達規(guī)律的基礎上，構(gòu)建豬1H3過表達載體并篩選有效的豬1H3 siRNA，轉(zhuǎn)染豬前體脂肪細胞并誘導其分化，采用油紅O染色、qRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測脂滴形成情況及成脂分化關鍵基因的表達變化，探究1H3基因?qū)ωi前體脂肪細胞分化及脂肪生成的影響，為闡明豬1H3基因的功能及作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

來源于大同市種豬場的30、90和240日齡的馬身豬各4頭，同一階段的個體按要求飼養(yǎng)，達到目標日齡時屠宰，采集背部脂肪組織，用于1H3基因發(fā)育性表達規(guī)律研究。5日齡杜長大仔豬(公)來源于山西省天祿豐種豬育種有限公司，屠宰后采集背部脂肪組織，分離培養(yǎng)豬前體脂肪細胞。本研究的試驗設計經(jīng)過山西農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會批準后實施。

1.2 主要試劑與載體

Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、RNAiso Plus regent和SYBR Premix Ex Taq II購于大連TaKaRa公司；Insulin和羅格列酮購自Sigma公司；I型膠原酶、DEX、IBMX、PBS粉末、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶和油紅O染液購于中國索萊寶公司；FBS和DMEM購自Gibco公司；Adiponectin抗體、NR1H3抗體、β-actin抗體購于博奧森公司；兔二抗購于LI-COR；轉(zhuǎn)染試劑Lipofecter 3000、過表達載體pIRES2-EGFP-3×flag購自漢恒生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測 參照TaKaRa RNAiso Plus和試劑盒說明書提取脂肪組織和細胞總RNA，按照 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以18為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR對1H3及相關標志基因的表達水平進行檢測，引物信息見表1。qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNAase Free ddHO補至20 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，35個循環(huán)；熔解曲線程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s，95 ℃。結(jié)果采用2法進行分析，每個樣本做3次技術(shù)重復。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information of qRT-PCR

1.3.2 豬前體脂肪細胞的分離、鑒定與誘導分化 5日齡杜長大仔豬放血處死后用75%酒精消毒，取背部皮下脂肪組織，用含2%青鏈霉素的PBS清洗3次后移入超凈工作臺；去除筋膜及結(jié)締組織，置于小燒杯中剪成肉糜狀；加入等體積Ⅰ型膠原酶消化液(2 mg·mL)，37 ℃消化30 min；加入等體積終止培養(yǎng)基(3% FBS+DMEM)終止消化；依次用70、200目 的篩子過濾，1 100 r·min離心5 min，獲得細胞沉淀；完全培養(yǎng)基重懸沉淀，加入10 cm培養(yǎng)皿中，于CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

采用細胞免疫熒光法檢測脂肪細胞因子Adiponectin含量以鑒定細胞的純度。細胞密度達70%～80%時，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次；4%多聚甲醛固定40 min；0.1%的Triton-100通透10 min，PBS洗3次；5% BSA封閉60 min，每孔加入100 μL Adiponectin鼠一抗(1∶100)，室溫孵育6 h，PBS洗3次； 加入適量FITC標記的熒光二抗(1∶100)，覆蓋孔板底部，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次；加入100 μL DAPI染液，避光染色10～15 min，PBS清洗數(shù)次；熒光顯微鏡下觀察并拍照。

前體脂肪細胞成脂分化的誘導采用“激素雞尾酒”法。待細胞長滿后，更換誘導分化培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+5 μg·mLInsulin+0.5 mmoL·LIBMX+1 μmoL·LDEX+1 gmoL·L羅格列酮+1%青鏈霉素)，培養(yǎng)2 d更換維持培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS+1%青鏈霉素+5 μg·mL胰島素)，培養(yǎng)8 d后收集細胞，期間2 d換1次液。

1.3.31H3基因過表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及相關標志基因的檢測 以實驗室前期獲得的豬1H3基因菌液為模板，利用同源重組引物(F:CTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACC-ATGTCCTTGTGGGTGGAGG；R:CACCGTCA-TGGTCTTTGTAGTCCATCTCGTGCACATCC-CAGATCTCAG)擴增含有過表達載體同源臂的目的片段，將目的基因片段通過同源重組連接到過表達載體pIRES2-EGFP-3×Flag上，構(gòu)建1H3基因過表達載體。

試驗設置過表達組和對照組，過表達組添加1H3-OE，對照組添加1H3-NC。當豬前體脂肪細胞生長至70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。分別將轉(zhuǎn)染試劑和載體加入到無血清的DMEM中，室溫靜置5 min后將兩者混合，靜置20 min，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，誘導分化，8 d后收集細胞，檢測1H3過表達效率及下游靶基因-1c和及成脂關鍵基因、、4和的表達量變化。

1.3.4 豬1H3 siRNA的合成、轉(zhuǎn)染及相關標志基因的檢測 根據(jù)NCBI上豬1H3的基因序列(登錄號：NM_001101814.1)，選擇不同位點設計3對1H3 siRNA，命名為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，對照組為siRNA-NC，由漢恒生物公司合成(表2)。

表2 NR1H3 siRNA序列信息Table 2 Sequence information of NR1H3 siRNA

采用脂質(zhì)體法分別將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 和siRNA-NC轉(zhuǎn)染入豬前體脂肪細胞，48 h 后收集細胞，檢測1H3基因的表達量，篩選干擾效果最佳的siRNA進行后續(xù)試驗。在豬前體脂肪細胞中分別轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-2，誘導分化10 d后收集細胞，檢測1H3下游靶基因-1c和及成脂關鍵基因、、4和的表達情況。

1.3.5 Western blot檢測成脂關鍵基因的表達 細胞成脂分化10 d后，收集蛋白質(zhì)樣品，100 ℃變性10 min；制備分離膠和濃縮膠進行SDS-PAGE，電泳條件為90 V 15 min，120 V 60 min，保持恒壓進行；5%奶粉封閉1 h；加入一抗(1∶1 000)4 ℃過夜；洗滌3次，加入二抗(1∶10 000)，避光孵育1 h；洗滌后觀察蛋白條帶，分析灰度值。

1.3.6 細胞油紅O染色 細胞成脂分化第10天，PBS漂洗3次，4%的多聚甲醛37 ℃固定30 min；PBS漂洗3次，加入油紅O染液37 ℃染色60 min；PBS漂洗5次，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 統(tǒng)計分析 應用SPSS version 22.0進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析探討馬身豬不同日齡背部皮下脂肪組織中1H3基因表達量的差異，采用Duncan’s法進行多重比較；試驗組與對照組相關基因及蛋白質(zhì)表達量之間的差異采用獨立樣本檢驗進行比較；<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 NR1H3基因在豬皮下脂肪組織中的發(fā)育性表達特性

馬身豬皮下脂肪組織1H3基因表達量隨日齡增加呈逐漸升高的趨勢，240日齡表達量最高，30日齡 表達量最低，差異極顯著(<0.01，圖1)，表明其對脂肪沉積可能發(fā)揮促進作用。

不同大寫字母代表差異極顯著(P<0.01)Different capital letters represent the extremely significant difference (P<0.01)圖1 不同日齡馬身豬皮下脂肪組織中NR1H3的相對表達量Fig.1 Relative expression of NR1H3 in subcutaneous adipose tissues of Mashen pigs at different ages

2.2 豬前體脂肪細胞的分離及其純度鑒定

分離的豬前體脂肪細胞形態(tài)為圓形、橢圓形、梭形等不規(guī)則形狀，6 d左右匯合度達到70%～80%(圖2A)。誘導分化后，前體脂肪細胞膨大變形，出現(xiàn)脂滴。隨著細胞密度不斷增加，脂滴逐漸增多，相鄰的小脂滴發(fā)生融合(圖2B)。

A. 豬前體脂肪細胞；B. 成脂誘導的豬前體脂肪細胞；C～E. Adiponectin標記的豬前體脂肪細胞純度鑒定A. Porcine preadipocytes； B. Adipogenic induction of porcine preadipocytes; C-E. Purity identification of porcine preadipocytes marked by Adiponectin圖2 豬前體脂肪細胞的分離與純度鑒定Fig.2 Isolation and purity identification of porcine preadipocytes

免疫熒光染色檢測Adiponectin的表達情況，發(fā)現(xiàn)綠色熒光均勻分布于胞漿(圖2C)，細胞核藍染(圖2D)，99%以上的細胞帶有綠色熒光，為陽性結(jié)果(圖2E)。因此，可鑒定所培養(yǎng)的細胞為豬前體脂肪細胞，純度在99%以上。

2.3 過表達NR1H3基因促進豬前體脂肪細胞的成脂分化

細胞培養(yǎng)到70%～80%融合時，將1H3-NC和1H3-OE轉(zhuǎn)染入豬前體脂肪細胞，48 h后，顯微鏡觀察GFP的表達情況，1H3-NC組和1H3-OE組的綠色熒光達到80%，轉(zhuǎn)染效率相似(圖3A、3B)。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與1H3-NC組相比，1H3-OE組1H3的mRNA表達水平上升7.63倍(<0.01，圖3C)，蛋白表達水平上升1.83倍(<0.01，圖3D、3E)，表明過表達成功。

A、B. 轉(zhuǎn)染NR1H3-NC和NR1H3-OE的豬前體脂肪細胞；C. NR1H3基因mRNA表達量；D、E. NR1H3蛋白表達量。**.P<0.01，下同A, B. Porcine preadipocytes transfected with NR1H3-NC and NR1H3-OE; C. The mRNA expression of NR1H3 gene; D, E. NR1H3 protein expression level.**. P<0.01, the same as below圖3 NR1H3基因在豬前體脂肪細胞中的過表達效率Fig.3 The over-expression efficiency of NR1H3 gene in porcine preadipocytes

將轉(zhuǎn)染1H3-NC和1H3-OE的豬前體脂肪細胞誘導分化后進行油紅O染色，結(jié)果顯示，與1H3-NC組相比，1H3-OE組的油紅O染色著色深(圖4A、4B、4C)；用酶標儀測定細胞的OD值，結(jié)果同樣存在極顯著差異(<0.01，圖4D)；1H3-OE組成脂分化關鍵基因、、和4及1H3基因下游靶標-1c和的mRNA水平均極顯著升高(<0.01，圖4E)。綜上結(jié)果表明，過表達豬1H3基因促進豬前體脂肪細胞的分化。

A. 油紅O染色結(jié)果；B、C. 細胞油紅O染色；D. NR1H3-NC和NR1H3-OE組 OD450 nm值；E. NR1H3-NC和NR1H3-OE組NR1H3及成脂關鍵基因mRNA表達量A. Oil red O staining results; B，C. Oil red O staining of cells; D. The OD value at 450 nm in NR1H3-NC and NR1H3-OE groups; E. The mRNA expression of NR1H3 and the key adipogenic genes in NR1H3-NC and NR1H3-OE groups圖4 過表達NR1H3對豬前體脂肪細胞分化的影響Fig.4 The effect of NR1H3 over-expression on differentiation of porcine preadipocytes

2.4 干擾NR1H3基因抑制豬前體脂肪細胞的成脂分化

與siRNA-NC組相比，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 組中1H3基因mRNA表達水平分別降低了71.9%、78.0%和42.3%(<0.01，圖5A)，siRNA-2 干擾效果最佳，用于后續(xù)試驗。Western blot結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-2組NR1H3表達水平下調(diào)了23.5%(<0.01，圖5B、5C)，表明干擾成功。

A. 不同NR1H3 siRNA組別NR1H3基因mRNA表達量；B～C. siRNA-NC和siRNA-2組NR1H3蛋白表達量A. The NR1H3 mRNA expressions in different NR1H3 siRNA groups; B-C. The NR1H3 protein expressions in NR1H3 siRNA-NC and siRNA-2 groups圖5 NR1H3干擾效率的檢測Fig.5 NR1H3 interference efficiency detection

將轉(zhuǎn)染入干擾載體的豬前體脂肪細胞誘導分化后進行油紅O染色，通過肉眼和倒置顯微鏡同樣明顯觀察到油紅O著色差異(圖6A、6B、6C、6D)；用酶標儀測定細胞的OD值，也存在極顯著差異(<0.01，圖6E)；與siRNA-NC組相比，siRNA-2組的1H3基因下游靶標-1c和及成脂分化關鍵基因、、和4的mRNA水平均極顯著降低(<0.01，圖6F)。綜上結(jié)果表明，干擾豬1H3基因抑制豬前體脂肪細胞的分化。

A、B. 油紅O染色結(jié)果；C、D. 細胞油紅O染色; E. siRNA-NC組和siRNA-2組OD 450 nm值；F. siRNA-NC組和siRNA-2 組成脂關鍵基因mRNA表達量A, B. Oil red O staining results; C, D. Oil red O staining of cells; E. The OD values at 450 nm in siRNA-NC and siRNA-2 groups; F. The mRNA expression of key adipogenic genes in siRNA-NC and siRNA-2 groups圖6 干擾NR1H3基因?qū)ωi前體脂肪細胞分化的影響Fig.6 The effect of NR1H3 siRNA on differentiation of porcine preadipocytes

3 討 論

脂肪的含量與分布會影響胴體品質(zhì)和肉的風味。脂肪的形成主要依賴脂肪細胞的增殖、分化，之后，三酰甘油不斷沉積，而成脂相關轉(zhuǎn)錄因子在脂質(zhì)沉積過程中發(fā)揮著關鍵調(diào)控作用。1H3是近年來在脂肪生成過程中發(fā)揮關鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，與多種脂肪酸合成酶的表達相關。研究發(fā)現(xiàn)，1H3小鼠下調(diào)了-1c和重要的脂肪形成酶、-1和表達水平，導致小鼠的脂肪生成減弱。敲低1H3抑制了山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化。經(jīng)過LXR激動劑處理可能增加脂肪細胞中甘油三酯的含量及脂質(zhì)蓄積。此外，1H3在乳腺脂質(zhì)合成過程中也發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，1H3可以通過直接與啟動子相互作用，影響-1的表達，從而促進乳脂合成；也可作用于-1c，然后影響的表達，調(diào)控脂肪酸的生成。

本研究中，過表達1H3后，-1c和的表達量顯著上調(diào)(<0.01)，脂肪生成標記基因、和4的表達量同樣極顯著上升(<0.01)，脂滴形成增加；干擾1H3則呈現(xiàn)相反趨勢，表明1H3在豬前體脂肪細胞的分化過程中具有促進作用，進而促進成脂過程。研究表明，-1c是1H3的關鍵靶標，參與調(diào)控脂肪酸生成相關酶的表達，進而調(diào)控脂肪細胞分化。顯著影響成脂相關基因和1的表達量，是脂肪組織必需的調(diào)控因子，1H3可激活的轉(zhuǎn)錄，從而激活脂肪形成基因，促進脂肪細胞分化?？梢姡?H3通過調(diào)控其下游靶標-1c和的表達水平影響成脂關鍵基因、和4的表達，進而影響豬前體脂肪細胞的分化，是豬前體脂肪細胞成脂分化的正調(diào)節(jié)劑。

盡管1H3在多個物種中都有研究，但其對于脂肪細胞分化的作用并不統(tǒng)一，可能是脂肪細胞分化正反兩方面的調(diào)節(jié)器。Ross等報道，LXR活性抑制原代前體脂肪細胞的分化和脂質(zhì)蓄積。1H3通過Wnt /β-catenin信號傳導對鼠間充質(zhì)干細胞(MSCs)的成脂分化具有抑制作用。這些不一致的結(jié)果可能反映了物種、細胞類型和培養(yǎng)條件等的差異。

1H3基因近年來受到廣泛的關注，已在小鼠和山羊等物種中證實與脂肪細胞脂質(zhì)積累相關，但在豬脂肪沉積中的作用鮮有報道。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，1H3-exon-5-A201C的C等位基因與背膘厚度有關，可能促進豬的脂質(zhì)沉積，并增加皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪含量，推斷與高脂質(zhì)沉積有關。本研究中，細胞試驗結(jié)果表明1H3是豬前體脂肪細胞成脂分化的正調(diào)節(jié)劑，而且1H3基因在馬身豬皮下脂肪組織的表達量隨著日齡的增長極顯著上升，與豬脂肪沉積的趨勢一致，表明該基因在調(diào)控豬脂肪代謝過程中可能發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

在馬身豬脂肪組織生長發(fā)育過程中，1H3基因的表達量隨年齡的增長呈逐漸升高趨勢，與豬脂肪沉積規(guī)律相符合。1H3是豬前體脂肪細胞成脂分化的正調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)控其下游靶標-1c和的表達水平影響成脂關鍵基因、和4的表達，進而影響豬前體脂肪細胞的分化。