PERK/ATF4/CHOP通路對(duì)BCG誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用

馬伯利，聶雪伊，劉悅陽，苗申奧，陳 通，楊 易，徐金瑞

(寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是世界范圍內(nèi)的慢性致死傳染病。2019年，TB導(dǎo)致全球140萬人死亡，其中包括20.8萬名艾滋病毒陽性者。結(jié)核分枝桿菌(，)是TB的主要致病菌，是一種典型的胞內(nèi)寄生菌。巨噬細(xì)胞是寄生的主要場(chǎng)所，也是感染早期免疫應(yīng)答的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，一方面它可以對(duì)抗和消滅，在宿主抗感染免疫中起到關(guān)鍵作用，另一方面也可通過阻止吞噬溶酶體的形成逃避巨噬細(xì)胞的清除。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到攻擊時(shí)，會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，促使蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)同免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin binding protein，Bip)解離，使 PERK 暴露并發(fā)生自身二聚化與磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，促使轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的表達(dá)上調(diào)，特異性地提高C/Ebp-同源蛋白質(zhì)(C/EBP-homologous protein，CHOP)等的轉(zhuǎn)錄水平

NLRP3炎性小體是目前研究最多的炎性小體，許多病原微生物都能激活NLRP3炎性小體。研究表明，ERS能夠激活NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而影響炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展，但其調(diào)控機(jī)制尚未明確。

本研究采用PERK抑制劑和PERK小干擾RNA預(yù)處理并經(jīng)BCG感染THP-1細(xì)胞后，對(duì)PERK/ATF4/CHOP通路相關(guān)分子的表達(dá)、NLRP3炎性小體活化相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，旨在揭示BCG感染THP-1細(xì)胞后PERK/ATF4/CHOP通路對(duì)NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用，為進(jìn)一步闡明巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)，GSK2656157(MedChemExpress，美國)，佛波酯(Sigma-Aldrich，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，中國)，Green qPCR SuperMix檢測(cè)試劑盒(全式金，中國)，Trizol(Ambion，美國)，PERK干擾序列(生工，中國)，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(凱基，中國)，M-PER、Lipofectamine RNAiMAX試劑(賽默飛，美國)，Protease inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich，美國)，β-巰基乙醇(索萊寶，中國)，Beta Actin兔源多克隆一抗、PERK/EIF2K3兔源多克隆一抗、ATF4兔源多克隆一抗、ASC兔源多克隆一抗、FITC偶聯(lián)的羊抗兔IgG (H+L) 二抗、HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG (H+L) 二抗(Proteintech，美國)，ASC兔源單克隆一抗、Caspase-1兔源單克隆一抗、NLRP3兔源單克隆一抗、CHOP兔源單克隆一抗(Cell Signaling Technology，美國)，Cleaved-Caspase-1 (Asp296, p20 Ab) 兔源單克隆一抗(Affinity，美國)，NLRP3鼠源多克隆一抗和AF594偶聯(lián)的羊抗鼠IgG (H+L)二抗(Abmart，中國)，人 IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒(博士德，中國)；CCK-8試劑盒(愛必信，中國)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(BioRAD公司，美國)，光學(xué)顯微鏡(Motic公司，中國)，Quantity Studio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、NanoDrop-8000超微量分光光度計(jì)(賽默飛，美國)，Amersham Imager600自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀(General Electric公司，美國)，Enspire熒光酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司，美國)，熒光共聚焦顯微鏡(賽默飛，美國)。

1.2 BCG培養(yǎng)

BCG購于成都生物制品研究所，培養(yǎng)步驟：配制含0.2%Tween-80的7H9培養(yǎng)液，高壓滅菌后，加入10% ADC Enrichment增菌液混勻。將BCG接種于已配制好的7H9培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，通過測(cè)定OD值確定BCG濃度。

1.3 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)

人單核巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，培養(yǎng)步驟：THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和0.05 mmol·Lβ-巰基乙醇的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，采用半換液法進(jìn)行傳代，傳代后靜置于37 ℃，5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將含有50 ng·mL佛波酯的THP-1細(xì)胞按每孔1×10個(gè)接種在6孔板中，于37 ℃，5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將其誘導(dǎo)貼壁，更換新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 BCG感染

以感染復(fù)數(shù)為10:1的BCG感染THP-1細(xì)胞0、2、6、12、24 h。在此基礎(chǔ)上，采用5 mmol·L的PERK抑制劑GSK2656157預(yù)處理細(xì)胞2 h，BCG感染24 h，設(shè)置4個(gè)組：對(duì)照組(C)、BCG感染組(BCG)、PERK抑制劑組(GSK2656157)和PERK抑制劑+BCG感染組(BCG +GSK2656157)。

1.5 qRT-PCR

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)組處理細(xì)胞后，用Trizol法提取總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照qRT-PCR試劑盒說明書添加各種試劑，置于PCR儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增試驗(yàn)，檢測(cè)目的基因mRNA水平的表達(dá)，用2-ΔΔ法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用引物相關(guān)信息見表1。

表1 qRT-PCR所用引物信息Table 1 The primers information of qRT -PCR

1.6 Western bolt檢測(cè)

按照“1.3”和“1.4”中的方法處理細(xì)胞后，提取各組蛋白，用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至已用甲醇激活的PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，分別過夜孵育β-actin(1∶3 000稀釋)、NLRP3 (1∶1 000稀釋)、ASC(1∶1 000稀釋)、Caspase-1(1∶1 000稀釋)、PERK(1∶1 000稀釋)、ATF4(1∶1 000稀釋)、CHOP(1∶1 000稀釋)等蛋白抗體，TBST洗滌6次，每次5 min，加熒光素偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h， TBST洗滌3次，每次5 min，TBS洗滌3次，每次5 min， 對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.7 干擾PERK

將接種好的THP-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siPERK和陰性對(duì)照siNC。siPERK序列為sense：5′-GUGGAAAGGUGAGGUAUAUTT-3′；antisense：5′-AUAUACCUCACCUUUCCACTT-3′。按照Lipofectamine2000說明書的操作要求配制質(zhì)粒和脂質(zhì)體復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)入37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置4個(gè)組：對(duì)照組(siNC)、BCG感染組(siNC+BCG)、siPERK干擾組(siPERK)和siPERK+BCG感染組(siPERK+BCG)。

1.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活率

取對(duì)數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，按1×10·mL細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，空白孔加入完全培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在BCG感染24 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，于4 h后使用熒光酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定各孔吸光度值(OD)并記錄其數(shù)據(jù)。細(xì)胞活率(%)=(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.9 ELISA檢測(cè)

將各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清收集于1.5 mL EP管中，每管500 μL；按試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行處理，用熒光酶標(biāo)儀在OD測(cè)定吸光值，計(jì)算結(jié)果。

1.10 免疫熒光檢測(cè)方法

將C組、BCG組、BCG+GSK2656157組細(xì)胞以每孔1.0×10個(gè)細(xì)胞密度分別接種于加有玻片的12孔板PMA誘導(dǎo)貼壁24 h，換新鮮培養(yǎng)液后細(xì)胞培養(yǎng)24 h, 抑制劑預(yù)處理細(xì)胞2 h， 用BCG處理細(xì)胞24 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，0.5% triton-X 100通透20 min，PBS漂洗3次；一抗(鼠源NLRP抗體、兔源ASC抗體)孵育過夜，PBS漂洗3次，加入熒光二抗(AF488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體)后暗盒37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，加入DAPI 染料染核，PBS漂洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BCG感染THP-1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活率的影響

為探究BCG感染THP-1細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活率的影響，采用CCK-8檢測(cè)BCG感染THP-1細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞活率，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，細(xì)胞活率隨感染時(shí)間逐漸降低，24 h達(dá)到最低，且差異極顯著(<0.001)。確定BCG最佳感染時(shí)間為24 h。

***. P<0.001圖1 BCG感染THP-1細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞活率檢測(cè)Fig.1 The viability of THP-1 cells infected with BCG at different time

2.2 BCG感染THP-1細(xì)胞后對(duì)NLRP3炎性小體相關(guān)分子和PERK蛋白表達(dá)的影響

在BCG感染THP-1細(xì)胞2、6、12、24 h，并設(shè)置未感染對(duì)照組，采用Western blot方法檢測(cè)PERK、p-PERK 蛋白及NLRP3炎性小體組成蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)。由圖2可見，與未感染對(duì)照組相比，BCG感染組NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、PERK及p-PERK蛋白的表達(dá)在24 h 均上調(diào)，且差異極顯著(<0.001)。因此，選擇BCG感染THP-1細(xì)胞24 h開展后續(xù)試驗(yàn)。

NS. P>0.05；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖2 BCG感染THP-1細(xì)胞不同時(shí)間后NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白和PERK蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The western blot results of the expressions of NLRP3 inflammasome related proteins and PERK protein in THP-1 cells infected with BCG at different times

2.3 BCG感染THP-1細(xì)胞后對(duì)IL-1β和IL-18釋放的影響

在NLRP3炎性小體活化時(shí)，Pro-IL-1β和Pro-IL-18會(huì)被NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸蛋白酶1(Cysteine aspartic acid specific protease 1，Caspase-1)復(fù)合物切割成成熟IL-1β和IL-18。為此，作者采用ELISA方法對(duì)IL-1β和IL-18的釋放量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，IL-1β和IL-18的釋放量隨感染時(shí)間逐漸升高，24 h達(dá)到最高，且差異極顯著(<0.001)。

ns. P>0.05；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖3 BCG感染THP-1細(xì)胞不同時(shí)間后IL-1β(a)和IL-18(b)的釋放Fig.3 Release of IL-1β (a) and IL-18 (b) in THP-1 cells infected with BCG at different times

2.4 干擾PERK對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

為驗(yàn)證PERK/ATF4/CHOP通路對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用，使用PERK的小干擾處理細(xì)胞并經(jīng)BCG感染后，采用qRT-PCR(圖4)和Western blot(圖5)檢測(cè)NLRP3炎性小體相關(guān)分子和PERK/ATF4/CHOP通路相關(guān)分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖4 干擾PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)分子mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The mRNA expression of NLRP3 inflammasome associated molecule in THP-1 cells infected by BCG with Small interfering RNA of PERK

由圖4可見，siNC+BCG感染組、4、、3、、-1分子的mRNA表達(dá)水平極顯著高于未感染對(duì)照組(<0.001)，siPERK+BCG組較siNC+BCG感染組上述分子的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(<0.05)或極顯著下調(diào)(<0.01)。

由圖5結(jié)果顯示，siNC+BCG感染組蛋白PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved-Caspase-1的蛋白表達(dá)水平極顯著(<0.000 1)或顯著(<0.05)高于未感染組，但siPERK+BCG組較siNC+BCG感染組關(guān)鍵蛋白如p-PERK和Cleaved-Caspase-1蛋白的表達(dá)極顯著下調(diào)(<0.001)。

2.5 抑制PERK對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞活性的影響

CCK-8細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組相比，BCG感染引起THP-1細(xì)胞活率下降，且差異極顯著(<0.001)；BCG+GSK2656157組與BCG組相比，細(xì)胞活率上升，差異顯著(<0.05)，表明GSK2656157能夠抑制BCG感染引起的THP-1細(xì)胞死亡。

a.相關(guān)蛋白的Western blot結(jié)果；b～i. 蛋白表達(dá)的灰度值分析。*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001a.The Western blot result of related proteins；b-i. Gray value analysis of proteins. *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖5 干擾PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞PERK/ATF4/CHOP通路及NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The expressions of PERK / ATF4 / CHOP pathway and NLRP3 inflammasome related proteins in THP-1 cells infected by BCG with Small interfering RNA of PERK

*. P<0.05；**. P<0.01圖6 抑制PERK對(duì)BCG感染的THP-1細(xì)胞活性的影響Fig.6 The activity of THP-1 cells infected by BCG with inhibition of GSK2656157

2.6 抑制PERK對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

為進(jìn)一步揭示PERK/ATF4/CHOP通路對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用，使用PERK抑制劑GSK2656157預(yù)處理THP-1細(xì)胞并經(jīng)BCG感染后，采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)NLRP3炎性小體相關(guān)分子和PERK/ATF4/CHOP通路相關(guān)分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。

由圖7可見，BCG感染組、4、、3、-1及的mRNA表達(dá)水平極顯著高于未感染對(duì)照組(<0.001)，BCG+GSK2656157組較BCG感染組上述分子的mRNA表達(dá)極顯著下調(diào)(<0.01)。

由圖8可見，BCG感染組PERK、ATF4、CHOP、NLRP3、Caspase-1及ASC的蛋白表達(dá)水平顯著高于未感染組(<0.05)，而BCG+GSK2656157組較BCG感染組上述蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(<0.05)。

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖7 抑制PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞NLRP3炎性小體相關(guān)分子mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The mRNA expression of NLRP3 inflammasome associated molecule in THP-1 cells infected by BCG with inhibition of GSK2656157

2.7 PERK抑制劑與BCG共處理的THP-1細(xì)胞NLRP3和ASC共定位檢測(cè)

熒光顯微鏡觀察C、BCG和BCG+GSK2656157組中的NLRP3和ASC表達(dá)結(jié)果如圖9所示。BCG組NLRP3和ASC表達(dá)較C組極顯著增加(<0.001)，BCG+GSK2656157組較BCG組NLRP3和ASC表達(dá)極顯著下調(diào)(<0.001)，NLRP3和ASC存在共定位。

a. 相關(guān)蛋白的Western blot結(jié)果；b～i. 蛋白表達(dá)的灰度值分析。*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001a. The Western blot result of related proteins；b-i. Gray value analysis of proteins. *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖8 抑制PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞PERK/ATF4/CHOP通路及NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果Fig.8 The expressions of PERK / ATF4 / CHOP pathway and NLRP3 inflammasome related proteins in THP-1 cells infected by BCG with inhibition of GSK2656157

a.NLRP3與ASC蛋白熒光共定位，綠色熒光抗體標(biāo)記ASC；紅色熒光抗體標(biāo)記NLRP3，標(biāo)尺=20 μm；b. NLRP3蛋白熒光強(qiáng)度分析；c. ASC蛋白熒光強(qiáng)度分析。*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001a.Fluorescent co localization of NLRP3 and ASC protein, and ASC was labeled with green fluorescent antibody; Red fluorescent antibody labeled NLRP3, Scale=20 μm; b. NLRP3 protein fluorescence intensity analysis; c. Fluorescence intensity analysis of ASC protein. *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖9 抑制PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞NLRP3和ASC的共定位表達(dá)Fig.9 Co-localization of NLRP3 and ASC proteins in THP-1 cells infected by BCG infection with PERK inhibitor

2.8 抑制PERK對(duì)BCG感染THP-1細(xì)胞IL-1β和IL-18釋放的作用

當(dāng)宿主細(xì)胞受到外界病原體刺激時(shí)，宿主細(xì)胞能夠分泌多種炎癥因子協(xié)助宿主清理病原體。為了探究PERK/ATF4/CHOP通路是否會(huì)影響B(tài)CG感染的THP-1細(xì)胞炎癥因子的分泌，采用ELISA方法抑制PERK并經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞IL-1β 和IL-18的釋放水平進(jìn)行檢測(cè)。由圖10可見，BCG感染組的IL-1β和IL-18的釋放水平極顯著高于未感染組(<0.001)，BCG+GSK2656157組較BCG感染組IL-1β和IL-18釋放顯著下調(diào)(<0.05)。 表明抑制PERK/ATF4/CHOP通路降低了BCG感染巨噬細(xì)胞后IL-1β和IL-18的釋放水平。

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001圖10 抑制PERK經(jīng)BCG感染的THP-1細(xì)胞IL-1β(a)和IL-18(b)釋放水平的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.10 ELISA results of IL-1β(a) and IL-18(b) release in THP-1 cells infected by BCG with inhibition of GSK2656157

3 討 論

結(jié)核病是由致病性結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，結(jié)核分枝桿菌可經(jīng)過呼吸道和消化道等途徑進(jìn)入機(jī)體，感染肺部形成肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌除了感染人之外，還可使不同動(dòng)物患病，比如：魚類、奶牛。隨著對(duì)利福平和異煙肼等抗結(jié)核一線藥物的耐藥性逐漸增加，讓結(jié)核病的防治變得更加困難。所以，明確與其靶細(xì)胞巨噬細(xì)胞間的相互作用機(jī)制對(duì)于治療結(jié)核病具有積極意義。

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成ERS，最終啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)，PERK/ATF4/CHOP通路作為UPR最關(guān)鍵的通路發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。有研究表明,PERK/ATF4/CHOP通路在調(diào)控ERS、炎癥和細(xì)胞凋亡方面具有重要作用。NLRP3作為目前研究比較清楚的炎癥小體類型，參與了不同類型疾病的發(fā)生，如痛風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病等。NLRP3參與免疫調(diào)控一般需要啟動(dòng)和激活兩個(gè)過程，啟動(dòng)階段需要通過核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)通路來啟動(dòng)NLRP3的轉(zhuǎn)錄。而細(xì)胞內(nèi)外K、Ca等離子的流動(dòng)、溶酶體的損傷、線粒體的功能障礙引起ROS的增加等因素會(huì)激活NLRP3。還有研究還表明，Caspase-11直接識(shí)別胞內(nèi)的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活NLRP3，引發(fā)ERS。

本研究結(jié)果表明，隨BCG感染時(shí)間延長，PERK、NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白的表達(dá)及促炎因子IL-1β及IL-18的釋放呈時(shí)間依賴性。為闡明PERK/ATF4/CHOP通路激活與BCG感染后NLRP3炎性小體活化之間的關(guān)系，分別采用PERK的小干擾RNA或抑制劑處理，并經(jīng)BCG感染THP-1細(xì)胞后，對(duì)NLRP3炎性小體活化水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，BCG感染后PERK/ATF4/CHOP通路和NLRP3炎性小體的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，IL-1β及IL-18的釋放水平增加，免疫熒光結(jié)果顯示NLRP3與ASC的表達(dá)水平升高，表明BCG感染激活了NLRP3炎性小體的活化，而加入PERK抑制劑再經(jīng)BCG感染后，上述分子的表達(dá)及炎性因子的釋放水平均顯著下降。

綜上所述，PERK/ATF4/CHOP通路參與了BCG感染THP-1細(xì)胞后NLRP3炎性小體的活化，為深入開展ERS在結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞中的作用奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

BCG感染巨噬細(xì)胞后引起PERK/ATF4/CHOP通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)了NLRP3炎性小體活化，并釋放促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18。