限時(shí)采食對(duì)豬生長(zhǎng)性能和肝代謝的影響

夏鵬軻，王紅玉，張 賀，蘇 勇，朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展，集約化養(yǎng)殖漸漸替代了傳統(tǒng)的養(yǎng)殖方法，如何降低料重比、提高飼料利用率并發(fā)揮其最大經(jīng)濟(jì)效益是養(yǎng)殖者追求的目標(biāo)。目前，我國養(yǎng)豬生產(chǎn)主要采用自由采食和分餐飼喂兩種方法進(jìn)行養(yǎng)殖。自由采食是指始終保證料槽內(nèi)有充足的飼料，豬可以根據(jù)自身意愿隨時(shí)采食，這種飼喂方式可實(shí)現(xiàn)豬的快速增重，有效降低人工勞動(dòng)成本，并且符合動(dòng)物福利要求，但也會(huì)不可避免地造成胴體偏肥、飼料利用率低等負(fù)面效果。分餐飼喂是指在兼顧豬增重的情況下，規(guī)定每天進(jìn)食的次數(shù)和時(shí)間，以期達(dá)到提高飼料利用率、降低料重比、改善肉品質(zhì)等目的。

研究表明，與自由采食生長(zhǎng)豬相比，每天飼喂兩次的豬平均日增重和平均日采食量都有下降的趨勢(shì)，但料重比要低于自由采食的豬。Le Naou等研究卻認(rèn)為，每天飼喂兩次會(huì)增加血漿葡萄糖、胰島素的波動(dòng)，可能會(huì)增加豬的生長(zhǎng)效率和速度，并且與頻繁進(jìn)食相比，大量但不頻繁的進(jìn)食并不會(huì)改變組織代謝能力，也不會(huì)改變組織成分和機(jī)體的脂肪含量。有研究發(fā)現(xiàn)，不同的飼喂方式會(huì)改變豬的肝轉(zhuǎn)錄，通過影響生長(zhǎng)豬的脂質(zhì)代謝來改變其生長(zhǎng)性能。目前，大多數(shù)報(bào)道主要集中在不同飼喂頻率對(duì)豬生長(zhǎng)和代謝的影響方面，如Schneider等研究每日飼喂2次或6次對(duì)豬生長(zhǎng)性能的影響，陳祥文等則研究每日飼喂3次和自由采食對(duì)豬生長(zhǎng)的影響。但這些對(duì)不同飼喂頻率的研究，很少有對(duì)單次采食的時(shí)間有所限制，對(duì)限時(shí)采食方面相關(guān)的報(bào)道也較少。有研究表明，與自由采食的小鼠相比，限時(shí)采食可以減少小鼠肝中蔗糖誘導(dǎo)的脂肪累積，改變肝脂質(zhì)代謝。Allee等的研究也表明，給予豬每天2 h時(shí)間采食，其脂肪組織中脂肪酸含量明顯高于自由采食組。這提示，限時(shí)采食可能通過影響肝的脂質(zhì)代謝進(jìn)而影響機(jī)體的整體代謝，但限時(shí)采食如何影響機(jī)體整體代謝尚不完全清楚。

肝作為動(dòng)物體內(nèi)的代謝中樞，轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析可解析豬的肝代謝對(duì)不同采食模式的響應(yīng)，同時(shí)，結(jié)合血清生化相關(guān)指標(biāo)，有助于了解限時(shí)采食對(duì)機(jī)體整體代謝的影響。因此，本研究采用一日三次飼喂并限制每次采食時(shí)間的方式，比較限時(shí)采食與自由采食模式下豬的生長(zhǎng)性能和肝代謝差異，旨在揭示限時(shí)采食影響生長(zhǎng)豬代謝的機(jī)制，為豬的高效生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物房進(jìn)行。試驗(yàn)選取體重相近((56.29±1.93)kg)的杜×長(zhǎng)×大三元雜交生長(zhǎng)豬12頭，采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分為對(duì)照組(CON組)和限時(shí)采食組(TRF組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。對(duì)照組每天飼喂1次，自由采食(給足飼料)；限時(shí)采食組每天飼喂3次(分別在07:00、12:00、17:00)，每次采食時(shí)間為1 h，期間飼喂足量飼料。試驗(yàn)期21 d，期間所有試驗(yàn)豬自由飲水，每天記錄采食量，每周記錄增重情況并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)性能。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，頸靜脈采集10 mL血液，在4 ℃下3 500 r·min離心10 min，取上層血清，-20 ℃保存，用于血清生化指標(biāo)的測(cè)定。通過頸靜脈注射4%戊巴比妥鈉溶液(40 mg·kg)將豬麻醉并安樂死。剖開腹腔迅速分離各個(gè)臟器，在肝的右葉中央部位采集樣品，分裝在2 mL凍存管中，置于液氮中保存，用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析。

1.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽汁酸(TBA)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖(GLU)、酰基載體蛋白(tACP)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TRIG)、載脂蛋白A(APOA)均使用全自動(dòng)生化分析儀(奧林巴斯AU400)測(cè)定。

1.4 肝代謝產(chǎn)物的測(cè)定

取50 mg肝組織樣本，加入800 μL 80%的甲醇，渦旋30 s；60 Hz研磨90 s，4 ℃超聲30 min；-40 ℃ 靜置1 h，渦旋30 s，4 ℃靜置0.5 h。置于4 ℃ 離心機(jī)中，12 000 r·min離心15 min。取盡上清液，于-40 ℃靜置1 h。置于4 ℃離心機(jī)中，12 000 r·min離心15 min。取200 μL上清液，加入5 μL內(nèi)標(biāo)(140 μg·mL，二氯苯丙氨酸)，于進(jìn)樣小瓶中待液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)檢測(cè)分析。色譜柱：C18色譜柱(Hyper gold C18 (100×2.1 mm，1.9 μm))；流動(dòng)相：水+5%乙腈+0.1%甲酸(A)，水+5%乙腈+0.1%甲酸(B)；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min；進(jìn)樣量：4 μL。

1.5 RNA的提取、測(cè)序和分析

取0.2 g肝組織樣品，使用購自美國Invitrogen公司的TRIzol試劑盒，按照說明書操作流程提取RNA?？俁NA樣品的純度、濃度和完整性經(jīng)檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入緩沖破碎液將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫。庫檢合格后，不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行匯集，用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的結(jié)果每個(gè)樣品Q30的值大于85%，都可以進(jìn)行接下來的數(shù)據(jù)分析。以上有關(guān)文庫的構(gòu)建、測(cè)序以及原始數(shù)據(jù)初步處理等操作均由北京百邁克生物技術(shù)有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”形式表示，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)對(duì)兩組生長(zhǎng)性能和血清指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，<0.05表示差異顯著，0.05≤<0.1表示有差異趨勢(shì)。

對(duì)預(yù)處理得到的代謝組數(shù)據(jù)，通過在線分析工具(www.metaboanalyst.ca)以識(shí)別代謝途徑和進(jìn)行代謝物組富集分析，并采用偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)處理，按照篩選變異權(quán)重參數(shù)值(variable importance inprojection, VIP)>1和<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異代謝物。對(duì)于差異代謝物的富集采用超幾何檢驗(yàn)方法。

對(duì)于轉(zhuǎn)錄組預(yù)處理所得的數(shù)據(jù)，按照差異倍數(shù)(FC>1.5或<0.67,<0.05) 作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異顯著的基因。再將篩選出來的差異顯著基因進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)性能

由表1可知，TRF組豬平均日增重顯著高于對(duì)照組(<0.05)，TRF組的料重比顯著低于對(duì)照組(<0.05)，兩組間平均日采食量沒有顯著差異。

表1 限時(shí)采食組與對(duì)照組中豬的生長(zhǎng)性能(n=6)Table 1 The growth performance of pigs in TRF and CON groups (n=6)

2.2 血清生化參數(shù)

如表2所示，與對(duì)照組相比，TRF組豬血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶的活性有升高的趨勢(shì)(<0.1)， 而總膽汁酸含量有降低趨勢(shì)(<0.1)，兩組間其他生化指標(biāo)濃度無顯著差異。

表2 限時(shí)采食組與對(duì)照組中生長(zhǎng)豬血清生化指標(biāo)Table 2 The serum parameters of pigs in TRF and CON groups

2.3 肝組織代謝組學(xué)分析

將各組數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共確定了247種肝代謝化合物，通過PLS-DA模型對(duì)代謝產(chǎn)物歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)限時(shí)采食組和對(duì)照組的肝代謝產(chǎn)物的區(qū)分較大，22.8%的差異可由橫坐標(biāo)PC1來解釋，14.8%的差異可由縱坐標(biāo)PC2來解釋。按照特定的篩選條件(VIP>1.0，<0.10)，兩組間的差異代謝物見表3， 與對(duì)照組相比，限時(shí)采食顯著增加了豬肝組織中N-乙酰亮氨酸和13Z二十二烯酰胺的濃度，同時(shí)降低了3種氨基酸(N6, N6, N6-三甲基-L-賴氨酸、焦谷氨酸和L-谷氨酸)、順丁烯二酸以及L-乙?；鈮A、黃嘌呤、對(duì)乙酰氨基酚、癸酰胺、煙酰胺的濃度。將篩選得出的差異代謝物進(jìn)行更深入的代謝通路富集分析，如圖2所示，限時(shí)采食組中有關(guān)谷胱甘肽代謝、氮代謝和D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝等途徑被顯著影響。

圖2 限時(shí)采食組與對(duì)照組豬肝組織中差異代謝物通路分析Fig.2 Pathway analysis of differential metabolites in livers of pigs in TRF and CON groups

表3 限時(shí)采食組與對(duì)照組相比肝中的顯著差異代謝物Table 3 Significant differential metabolites in livers of pigs in TRF and CON groups

圖1 限時(shí)采食組與對(duì)照組豬肝組織代謝組譜最小二乘法判別分析Fig.1 Partial least squares discriminant analysis of pig liver metabolites in TRF and CON groups

2.4 肝基因表達(dá)譜

對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)按照FC>1.5或<0.67，<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，如圖3顯示，與對(duì)照組相比，限時(shí)采食顯著改變了肝組織中218個(gè)基因的表達(dá)，其中有105個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，113個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。在這些差異表達(dá)基因中，與脂肪酸代謝相關(guān)的基因1和2在TRF組的表達(dá)量顯著上升，而4、2和1A的表達(dá)顯著下調(diào)；此外，氨基酸代謝相關(guān)基因在限時(shí)采食組中的表達(dá)顯著增高，而、和的表達(dá)被顯著抑制；此外，限時(shí)采食也影響參與碳水化合物代謝的基因表達(dá)，顯著上調(diào)3的表達(dá)，下調(diào)的表達(dá)(表4)。

表4 限時(shí)采食組的豬肝組織中脂肪酸代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝相關(guān)基因與對(duì)照組組表達(dá)比較Table 4 Differential expressed genes involved in pathways relating to fatty acid metabolism, amino acid metabolism and carbohydrate metabolism in the liver of pigs in TRF group compared with CON group

圖3 限時(shí)采食對(duì)生長(zhǎng)豬肝組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的影響Fig.3 Effect of time-restricted feeding on the transcriptional profiles in the liver of growing pigs

將篩選所得的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)(表5)，與對(duì)照組相比，TRF組中氨基酸生物合成，D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝，脂肪酸代謝，精氨酸生物合成，碳代謝，花生四烯酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝等途徑被顯著影響(<0.05)。

表5 限時(shí)采食組與對(duì)照組生長(zhǎng)豬肝組織中差異表達(dá)基因KEGG富集分析Table 5 KEGG pathway enrichment analysis of the differentially expressed genes in the liver between TRF and CON groups

對(duì)差異基因進(jìn)行GO類別分析和途徑富集分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，在GO類別的生物進(jìn)程水平中，與對(duì)照組相比，TRF組的差異基因大多集中在細(xì)胞過程、單生物過程、生物調(diào)節(jié)和代謝過程中；在GO類別的細(xì)胞組成位置中，TRF組的差異基因主要在細(xì)胞器、細(xì)胞膜和高分子絡(luò)合物等位置發(fā)揮作用；而在GO類別的分子功能方面，TRF組的差異表達(dá)基因主要參與結(jié)合和催化活性等方面。

圖4 限時(shí)采食組與對(duì)照組相比差異基因富集在生物進(jìn)程(A)、細(xì)胞組成(B)和分子功能(C)的GO功能注釋Fig.4 GO term enrichment analysis of the biological processes (A), cellular-component (B)， and molecular function (C) of differentially expressed genes in the livers of pigs in TRF group compared with the CON group

3 討 論

本試驗(yàn)比較了兩種不同飼喂模式對(duì)豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和肝代謝的影響，發(fā)現(xiàn)分餐限時(shí)采食組豬的增重更高，料重比更低，這與Colpoys等研究結(jié)果一致。然而，也有研究表明，減少飼喂次數(shù)限制飼喂時(shí)間可以減少豬的體重但不影響采食量。結(jié)果不一致可能與日糧組成、豬的品種或日齡不同有關(guān)。限時(shí)采食雖然未顯著影響采食量，但是顯著降低了料重比，說明限時(shí)采食可以改善飼料轉(zhuǎn)化率。在血清生化指標(biāo)中，試驗(yàn)組主要影響丙

數(shù)據(jù)結(jié)果以差異倍數(shù)(值)的形式展示；當(dāng)差異倍數(shù)>1.5或<0.67，<0.05 則認(rèn)為差異顯著；4：載脂蛋白A4；2：極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶；1A：肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A；1：脂肪酸結(jié)合蛋白1；2：乙?；o酶A合成酶2；：L-絲氨酸/蘇氨酸氨裂解酶；：丙酮酸羧化酶；：半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；：谷氨酰胺合成酶；3：核苷酸焦磷酸酶；：亞甲基四氫葉酸還原酶Data were presented as fold change (-value); The gene expressions were considered to be significantly altered when fold change> 1.5 or<0.67,<0.05;4: Apolipoprotein A-IV;2: Elongation of very-long-chain fatty acids;1A: Recombinant carnitine palmitoyltransferase 1A;1: Fatty acid-binding protein type 1;2: Acetyl-CoA acyltransferase 2;: L-serine/L-threonine ammonia-lyase;： Pyruvate carboxylase;: Homocysteine methyltransferase;: Glutamine synthetase;3: Ectonucleotide pyrophosphatase;: Methylenetetrahydrofolate reductase氨酸轉(zhuǎn)氨酶和肌酸激酶的活性以及總膽汁酸的濃度。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是一種反映機(jī)體氮代謝狀況的生化參數(shù)，也是動(dòng)物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶，影響多種氨基酸的代謝，本試驗(yàn)結(jié)果表明，限時(shí)飼喂可以提高丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性進(jìn)而提高生長(zhǎng)豬對(duì)氨基酸的利用。血清中的總膽汁酸是由膽固醇在肝中代謝而來，限時(shí)采食組豬的血清總膽汁酸含量較對(duì)照組低，在一定程度上說明肝對(duì)膽固醇的代謝存在差異。這些結(jié)果表明，限時(shí)采食可以改變豬機(jī)體氨基酸和脂質(zhì)的代謝。Le Naou等發(fā)現(xiàn)，每天更少的攝食頻率可以增加飼料向體重的轉(zhuǎn)換，并且未觀察到限時(shí)采食對(duì)甘油三酯濃度的影響，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析研究了限時(shí)采食對(duì)豬肝代謝的影響。與對(duì)照組相比，限時(shí)采食組豬中發(fā)現(xiàn)218個(gè)差異表達(dá)基因，這些差異基因存在于不同的生物學(xué)過程中。肝是脂肪酸主要的合成場(chǎng)所，因此肝是研究脂質(zhì)代謝的重要組織。KEGG通路顯示，限時(shí)采食顯著影響了脂肪酸代謝通路和脂肪酸伸長(zhǎng)的通路。本試驗(yàn)中TRF組的2基因和1基因的表達(dá)量較高，分別是對(duì)照組的1.81倍和1.68倍。2是乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶兩種異構(gòu)體中的一種，該酶通過催化脂肪β-氧化途徑的最后一步參與線粒體脂肪酸的延伸和降解。2普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)，催化游離膽固醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酯化膽固醇，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝。肝脂肪酸結(jié)合蛋白(1) 是脂質(zhì)結(jié)合蛋白超級(jí)家族中的一員，對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸表現(xiàn)出高親和力，并在脂質(zhì)的代謝和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中發(fā)揮作用。有研究表明，肝脂肪酸結(jié)合蛋白對(duì)花生四烯酸的攝取具有高親和力，它可以將花生四烯酸磷脂化，使之合成為花生四烯酰乙醇酰胺(AEA)和2-花生四烯酰甘油(2-AG)。1基因參與了花生四烯酸的代謝，這也與差異代謝物通路分析中的丁酸代謝通路被顯著影響對(duì)應(yīng)。以上結(jié)果提示，限時(shí)飼喂可能會(huì)改變肝脂肪酸的含量，改變肝中脂肪的合成。

有研究表明，不同飼喂頻率可影響生長(zhǎng)豬對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率。本研究中，KEGG通路顯示，限時(shí)采食顯著影響氨基酸的生物合成和精氨酸及鳥氨酸的代謝。此外，代謝組學(xué)分析顯示,限時(shí)采食顯著降低肝中三甲基-L-賴氨酸、焦谷氨酸和L-谷氨酸的濃度。這可能與TRF組上調(diào)基因有關(guān)。谷氨酰胺合成酶基因()是合成谷氨酰胺的關(guān)鍵基因，谷氨酰胺是體內(nèi)氨轉(zhuǎn)移的重要載體，促進(jìn)組織中谷氨酰胺的合成是提高機(jī)體氮利用率的有效途徑，在包括肝在內(nèi)的大部分組織中存在，細(xì)胞外谷氨酰胺的攝取可有效誘導(dǎo)肝細(xì)胞腫脹。有研究指出，谷氨酰胺可以通過鈉依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)集中攝入到肝細(xì)胞中，通過誘導(dǎo)細(xì)胞腫脹和體積調(diào)節(jié)離子通量的介導(dǎo)來抑制自噬蛋白的水解。該結(jié)果表明，TRF組豬可以增加谷氨酰胺合成酶的活性來降低肝中部分氨基酸的含量，提高其他靶組織谷氨酰胺的合成，促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

本研究表明，限時(shí)采食可以影響肝中的氨基酸代謝，改變脂肪酸和蛋白質(zhì)在肝中的代謝，調(diào)控生長(zhǎng)豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，改善生長(zhǎng)性能。