牦牛RBM3的基因克隆及其在不同繁殖時(shí)期卵巢、輸卵管、子宮中的表達(dá)定位

張 暉，潘陽(yáng)陽(yáng)，王靖雷，張 瑞，黃嘉馨，余四九，崔 燕

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)作為一種已知的冷休克蛋白，在正常條件下存在于多種組織和細(xì)胞中，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體與細(xì)胞在受到低溫、低氧和局部缺血應(yīng)激時(shí)可以刺激它的表達(dá)，并通過促進(jìn)其他相關(guān)蛋白的合成維護(hù)應(yīng)激條件下機(jī)體與細(xì)胞的正常生理功能。從人類組織分離得到的RBM3分子量為17 ku，最長(zhǎng)的開放閱讀框編碼157個(gè)氨基酸。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，RBM3包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是氨基酸末端的RNA識(shí)別基序(RRM)，它包含兩個(gè)高度保守序列：核糖核蛋白1(ribonucleoprotein1, RNP1)和核糖核蛋白2(ribonucleoprotein2, RNP2)；另一個(gè)是富含甘氨酸、精氨酸和酪氨酸的羧基末端序列。RBM3作為一種富含甘氨酸的蛋白質(zhì)，通過加速核糖體組裝、穩(wěn)定mRNA和減少microRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯。Wellmann等在人類成纖維細(xì)胞內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，RBM3的mRNA和蛋白質(zhì)在缺氧條件下的表達(dá)量有所增加。李云龍等也提出，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)RBM3蛋白的表達(dá)量會(huì)隨著溫度的降低而不斷增加。

研究證實(shí)，RBM3可以在包括人體細(xì)胞k562、HepG2、T24在內(nèi)的多種細(xì)胞系中表達(dá)。而有關(guān)小鼠()的研究表明，RBM3可通過減少microRNA表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(N2a)中的整體翻譯水平。Yan等研究發(fā)現(xiàn)，RBM3促進(jìn)了在缺氧條件下神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)的增殖。另外，RBM3在黑熊()這類冬眠動(dòng)物的肌肉、肝和心中都有表達(dá)，并且在松鼠()冬眠晚期的心、肝、腦組織中高表達(dá)。2020年，潘陽(yáng)陽(yáng)等通過試驗(yàn)驗(yàn)證了RBM3參與牦牛()這一高原特有哺乳動(dòng)物卵丘細(xì)胞低溫應(yīng)激調(diào)控。因此，研究在高寒低氧環(huán)境中哺乳動(dòng)物經(jīng)受低溫時(shí)RBM3的表達(dá)變化，有利于RBM3參與調(diào)控動(dòng)物機(jī)體缺氧、低溫的機(jī)制研究。而牦牛作為在我國(guó)青藏高原地區(qū)的特有動(dòng)物，由于長(zhǎng)期生活在高寒低氧的高原地區(qū)，生態(tài)學(xué)特征獨(dú)特。受到溫度、含氧量等因素以及生存環(huán)境的綜合影響，牦牛的繁殖能力低下，在自然條件下一年一胎或兩年一胎限制了高原畜牧業(yè)的發(fā)展。所以，研究低溫相關(guān)蛋白R(shí)BM3對(duì)牦牛生理調(diào)控機(jī)制具有重要作用。

本研究采集不同繁殖時(shí)期(卵泡期、黃體期和妊娠期)雌性牦牛的卵巢、輸卵管、子宮，進(jìn)行牦牛3基因克隆和相關(guān)生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)3 mRNA的表達(dá)量，利用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot, WB)檢測(cè)RBM3蛋白的表達(dá)量，利用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)RBM3蛋白的表達(dá)定位，為探討RBM3在高原環(huán)境下對(duì)牦牛生殖的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年10月在青海省馬佳肴屠宰場(chǎng)采集樣品。卵泡期、黃體期和妊娠期的4～6歲健康雌性牦牛各3頭。采集卵巢上見成熟卵泡(卵泡期)和新鮮黃體(黃體期)同側(cè)以及妊娠3個(gè)月(妊娠期)妊娠側(cè)的卵巢、子宮和輸卵管。將所采樣品修剪后，用生理鹽水沖洗干凈，一部分儲(chǔ)存于-80 ℃，另一部分室溫下保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.2 主要儀器與試劑

普通PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，qRT-PCR儀購(gòu)于瑞士Roche公司，顯微拍照儀購(gòu)于日本Olympus公司，多功能成像儀購(gòu)于美國(guó)GE公司；BeyoEcL PLus液購(gòu)于上海碧云天公司，Trizol試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，TB GreenPremix Ex TaqⅡ、JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于大連TaKaRa公司；熒光定量PCR所用試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Promega公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；基因克隆試驗(yàn)配制培養(yǎng)基所用試劑購(gòu)于北京Solarbio公司；IHC試劑盒、WB所用抗體Rabbit Anti-beta-Actin antibody、Rabbit Anti-RBM3 antibody、Goat Anti-Rabbit IgG HH&L/RP以及DAB顯色液購(gòu)于北京Bioss公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 牦牛RBM3基因克隆

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank公布的牛()3基因序列(XM_024987852.1)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，肌動(dòng)蛋白(-)基因?yàn)閮?nèi)參，由上海生工進(jìn)行引物合成，引物信息見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences amplifying target and house-keeping genes

1.3.2 總RNA提取 試劑盒法提取樣品總RNA，測(cè)定所提取的RNA濃度和OD/OD值后，將達(dá)到濃度和OD/OD值參照標(biāo)準(zhǔn)的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 牦牛3基因克隆 以樣品cDNA為模板擴(kuò)增3基因。總反應(yīng)體系為20 μL：TaqPCR Master Mix 10 μL, ddHO 8 μL, cDNA模板1 μL, 10 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃保存5 min，循環(huán)35次進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，回收產(chǎn)物于-20 ℃保存。用TaKaRa試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒，將回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector連接，然后把連接產(chǎn)物(10 μL)轉(zhuǎn)化至 JM109感受態(tài)細(xì)胞(100 μL)。 把連接轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物加入890 μL SOC液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(37 ℃, 200 r·min)15 h， 涂布于LB瓊脂平板培養(yǎng)基(含有Amp, X-gal, IPTG)上進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃, 14 h)，挑取平板培養(yǎng)基上的單個(gè)白色菌落并將其置于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h。最后，將得到的菌液進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)3基因進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 對(duì)牦牛3基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，具體分析網(wǎng)站信息見表2。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站Table 2 Bioinformatics analysis websites

1.4 qRT-PCR檢測(cè)RBM3基因的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)牦牛不同繁殖階段卵巢、輸卵管、子宮中3基因的表達(dá)水平。在20 μL (TB GreenPremix Ex TaqⅡ 10 μL，F(xiàn)ree Water 6.4 μL, cDNA模板2 μL，10 μmol·L的上、下游引物各0.8 μL)的體系下以95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、 60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，重復(fù)4次。按照2計(jì)算3基因在每組樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)RBM3蛋白的表達(dá)

1.5.1 蛋白樣品的制備 將試驗(yàn)樣品低溫研磨后取110 mg，按照蛋白裂解液(Radio Immunoprecipitation assa, RIPA)與蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)100∶1的比例配制蛋白裂解液并取110 μL加入研磨好的試驗(yàn)樣品。然后4 ℃振蕩裂解2 h后，4 ℃離心(12 000×g)5 min， 吸取上清在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 蛋白質(zhì)免疫印跡 經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，電泳后電轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，5%脫脂牛奶室溫振蕩封閉2 h。 將目的條帶和內(nèi)參條帶分別加一抗兔抗RBM3抗體(1∶1 000 PBST稀釋)和兔抗beta-Actin抗體(1∶2 000 PBST稀釋)4 ℃孵育11 h后用PBST(PBS∶Tween20=2 000∶1) 溶液洗10次(6 min·次)； 山羊抗兔IgG H&L/HRP(1∶3 000 PBST稀釋)二抗室溫?fù)u床孵育1 h后PBST溶液洗6次， 每次15 min；在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光液避光孵育2 min后WB掃描成像儀掃描蛋白條帶，重復(fù)3次， 最后分析RBM3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 IHC定位RBM3蛋白表達(dá)

固定組織，依次脫水、包埋、切片(厚度4 μm)、脫蠟、熱修復(fù)。再進(jìn)行如下步驟：滴加3% HO并在濕盒孵育10 min(37 ℃)；滴加封閉液在濕盒孵育15 min(37 ℃)；滴加一抗兔抗RBM3抗體(1∶400 PBS稀釋)在濕盒孵育過夜(4 ℃)，同時(shí)設(shè)置只加PBS(0.02 mol·L)的對(duì)照；滴加二抗(B液)在濕盒孵育15 min(37 ℃)；滴加C液在濕盒孵育15 min (37 ℃)；顯色。最后蘇木精復(fù)染、脫水、透明、樹脂封片并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)qRT-PCR結(jié)果計(jì)算3的相對(duì)表達(dá)量，利用Image J軟件灰度值分析RBM3蛋白的表達(dá)量(目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)，運(yùn)用SPSS軟件對(duì)基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性進(jìn)行單因素方差分析，用軟件GraphPad Prism 8繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛RBM3基因的擴(kuò)增與克隆

PCR結(jié)果顯示(圖1)，9組樣品在618 bp處出現(xiàn)預(yù)期的整齊條帶。與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)與參考序列將3基因克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，相似性100%。已將牦牛3序列提交至GenBank(登錄號(hào)：MF142258.1)。本部分試驗(yàn)檢測(cè)出了牦牛3序列，此結(jié)果將繼續(xù)用于后續(xù)生物信息學(xué)分析等試驗(yàn)內(nèi)容。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.卵泡期、黃體期、妊娠期卵巢；4～6.卵泡期、黃體期、妊娠期輸卵管；7～9.卵泡期、黃體期、妊娠期子宮M.DL2000 DNA Marker; 1-3. The ovary at follicular, luteal, gestation phases; 4-6. The fallopian tube at follicular, luteal, gestation phases; 7-9. The uterus at follicular, luteal, gestation phases圖1 RBM3 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of RBM3 PCR amplification

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛3基因開放閱讀框分析 開放閱讀框分析發(fā)現(xiàn)，牦牛3的開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為483 bp，編碼了160個(gè)氨基酸。選取具有代表性的動(dòng)物進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果顯示牦牛3基因與野牦牛()相似性最高(99.79%)，相似性較高的還有數(shù)值為99.59%的瘤牛()與99.17%的普通牛()；與其他動(dòng)物的相似性從高到低依次為：山羊()98.96%、彎角劍羚()98.76%、水牛()97.17%、綿羊()96.16%、單峰駝()91.36%、羊駝()91.36%、野駱駝()91.36%、西伯利亞虎()91.30%。經(jīng)MEGA 7.0軟件比對(duì)(圖2)后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖3)，牦牛3基因與野牦牛親緣關(guān)系最近。將牦牛與包括基因相似性最高的野牦牛在內(nèi)的所有在列動(dòng)物相比，3基因編碼區(qū)序列在第98位核苷酸(圖2黑色箭頭處)有差異，且對(duì)應(yīng)編碼的第33位氨基酸在牦牛上是苯丙氨酸(Phe)，而在其他動(dòng)物上編碼的結(jié)果是絲氨酸(Ser)。另外，第51位核苷酸的比對(duì)中，牦牛、野牦牛和除西伯利亞虎之外的所有在列動(dòng)物都有差異，但其編碼的氨基酸均為蘇氨酸(Thr)，沒有改變。

黑色箭頭標(biāo)記是第51、98位核苷酸Black arrows point to nucleotide No.51 and No.98圖2 不同物種間RBM3基因序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of RBM3 orthologues among different species

圖3 RBM3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RBM3 gene

2.2.2 牦牛3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) RBM3蛋白預(yù)測(cè)分子量大小17.5 ku。分析后得知，3基因編碼了含有18種氨基酸在內(nèi)的160個(gè)氨基酸，甘氨酸(Gly)的含量最高，為21.2%；含量最低的是組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸 (Lys)、和甲硫氨酸(Met)，含量為1.9%；半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)的含量為0。3基因編碼的氨基酸中含有帶負(fù)電的氨基酸(Asp+Glu)20個(gè)(12.5%)，帶正電氨基酸(Arg+Lys)22個(gè)(13.8%)。該編碼區(qū)共2 361個(gè)蛋白原子，理論等電點(diǎn)(PI)8.83，不穩(wěn)定指數(shù)為24.58，是穩(wěn)定蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖4A)，構(gòu)成RBM3蛋白α-螺旋的氨基酸個(gè)數(shù)為21個(gè)，占氨基酸總數(shù)的13.1%；構(gòu)成RBM3蛋白延伸鏈的氨基酸有30個(gè)， 占18.8%；109個(gè)氨基酸無(wú)規(guī)則卷曲，占68.1%。RBM3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4B所示。

A. 牦牛RBM3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B.牦牛RBM3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的兩個(gè)不同角度A. The secondary structure prediction of RBM3 protein in yak; B. Prediction of tertiary structure of yak RBM3 protein from two different angles圖4 牦牛RBM3蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The structure prediction of RBM3 protein in yak

2.2.3 牦牛RBM3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)分析 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5A)表明RBM3蛋白不是跨膜蛋白。蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果(圖5B)表明，在組成RBM3蛋白的氨基酸中有10個(gè)絲氨酸(Ser)、2個(gè)蘇氨酸(Thr)、5個(gè)酪氨酸(Tyr)的磷酸化位點(diǎn)具備成為蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點(diǎn)的條件。

A.牦牛RBM3蛋白跨膜區(qū)域分析；B.牦牛RBM3蛋白磷酸化位點(diǎn)分析A.The protein transmembrane regional analysis of RBM3 protein in yak; B. The protein phosphorylation site analysis of RBM3 protein in yak圖5 牦牛RBM3蛋白跨膜區(qū)域和磷酸化位點(diǎn)分析Fig.5 The protein transmembrane region and phosphorylation sites analysis of RBM3 protein in yak

2.3 RBM3基因表達(dá)檢測(cè)

qRT-PCR結(jié)果(圖6)顯示，3基因在不同繁殖階段的牦牛卵巢、輸卵管、子宮中都有表達(dá)。在卵巢中，3基因在卵泡期的表達(dá)量顯著低于黃體期和妊娠期(<0.05)；在輸卵管中，3基因在卵泡期的表達(dá)量顯著高于黃體期和妊娠期(<0.05)；在子宮中，3基因在各時(shí)期表達(dá)量存在明顯差異，卵泡期最低，黃體期和妊娠期較高(<0.05)。3基因在牦牛發(fā)情周期不同階段的主要生殖器官上呈差異性表達(dá)。

β-actin為內(nèi)參基因；n=4。不同字母代表差異顯著(P<0.05)β-actin is the reference gene; n=4. Different letters indicate significanct difference (P<0.05)圖6 RBM3 mRNA在牦牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of RBM3 mRNA in different tissues in yak

2.4 RBM3蛋白表達(dá)檢測(cè)

WB結(jié)果(圖7A)表明，RBM3蛋白在卵泡期、黃體期、妊娠期的牦牛卵巢、輸卵管、子宮中都有表達(dá)且存在差異。通過定量分析(圖7B)在卵巢上，RBM3蛋白在黃體期的表達(dá)量最高，妊娠期次之，卵泡期最低，3個(gè)樣本之間差異顯著(<0.05)；在輸卵管上，RBM3蛋白在黃體期和妊娠期表達(dá)較高且兩者之間差異不顯著(>0.05)，卵泡期的表達(dá)量最低，和同組的其他兩個(gè)樣本之間的差異均顯著(<0.05)； 在子宮中，RBM3蛋白在妊娠期的表達(dá)量最低，卵泡期的表達(dá)量最高，黃體期的表達(dá)量介于卵泡期和妊娠期之間，3個(gè)樣本間差異顯著(<0.05)。

A.RBM3和β-actin蛋白在牦牛不同組織中的檢測(cè)結(jié)果；B.RBM3蛋白在牦牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。1～3. 卵泡期、黃體期、妊娠期卵巢；4～6. 卵泡期、黃體期、妊娠期輸卵管；7～9. 卵泡期、黃體期、妊娠期子宮A. Detection results of RBM3 and β-actin in different tissues of yak; B. Relative expression of RBM3 in different tissues of yak. 1-3. The ovary at follicular, luteal, gestation phases; 4-6. The fallopian tube at follicular, luteal, gestation phases; 7-9. The uterus at follicular， luteal, gestation phases圖7 RBM3蛋白在牦牛不同組織中的表達(dá)情況Fig.7 Expression of RBM3 protein in different tissues of yak

2.5 牦牛RBM3蛋白在主要生殖器官的定位檢測(cè)結(jié)果

通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)(圖8)發(fā)現(xiàn)，RBM3蛋白在牦牛發(fā)情不同階段的卵巢、輸卵管、子宮切片中都有陽(yáng)性表達(dá)，且均為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。在卵巢上(圖8A、8B、8C)RBM3的主要表達(dá)分布在卵泡顆粒層(follicle granular layer, SG)、卵泡膜(theca follicle, TF)、黃體細(xì)胞(luteal cells, LC)；RBM3在輸卵管上(圖8D、8E、8F)的主要表達(dá)位置為黏膜上皮(epithelium mucosae, EM)；RBM3在子宮上(圖8G、8H、8I)的主要表達(dá)位置為子宮內(nèi)膜(endometrium, EN)和子宮腺(uterine glands, UG)。

A-I. 陰性表達(dá)；A1、A2、B1、B2、C1、C2. 卵巢；D1、D2、E1、E2、F1、F2. 輸卵管；G1、G2、H1、H2、I1、I2. 子宮。SG. 卵泡顆粒層；TF. 卵泡膜；LC. 黃體細(xì)胞；EM. 黏膜上皮；EN. 子宮內(nèi)膜；UG. 子宮腺。卵泡期. A組、D組、G組；黃體期. B組、E組、H組；妊娠期. C組、F組、I組A-I. Negative expression; A1, A2, B1, B2, C1, C2. Ovary; D1, D2, E1, E2, F1, F2. Fallopian tube; G1, G2, H1, H2, I1, I2. Uterus. SG. Follicle granular layer; TF. Theca follicle; LC. Luteal cells; EM. Epithelium mucosae; EN. Endometrium; UG. Uterine glands. Follicular phase. Group A, D and G; Luteal phase. Group B, E and H; Gestation phase. Group C, F and I圖8 RBM3蛋白在在牦牛不同組織中的分布Fig.8 Distribution of RBM3 proteins in different tissues of yak

3 討 論

RBM3作為動(dòng)物體內(nèi)的一種應(yīng)激調(diào)節(jié)基因，其與冷應(yīng)激的關(guān)系在1997被發(fā)現(xiàn)，但越來(lái)越多的研究表明它在細(xì)胞中有著較為復(fù)雜的功能和作用。在正常生理?xiàng)l件下，它可以保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)在刺激造成的損傷，而在機(jī)體遭受低溫、低氧等應(yīng)激刺激時(shí)，則會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)并通過多種途徑調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的RBM3表達(dá)量增加時(shí)，機(jī)體對(duì)抗外界有害刺激的能力就會(huì)有所增加，從而在惡劣環(huán)境下為細(xì)胞提供一個(gè)較為良好的內(nèi)部環(huán)境。近些年來(lái)，RBM3被認(rèn)為是潛在的原癌基因進(jìn)行了大量與之相關(guān)的研究，但對(duì)其參與生殖調(diào)控的研究卻不多。本研究成功克隆了牦牛3基因，分析后發(fā)現(xiàn)其N端含有特殊蛋白結(jié)構(gòu)域RNP1和RNP2，與前人研究結(jié)果一致，存在RGG結(jié)構(gòu)域。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RBM3與部分冷休克蛋白(cold shock proteins, CSPs)具有中度核苷酸序列和功能相似性，在進(jìn)化過程中保守，本研究結(jié)果顯示牦牛3與野牦牛、瘤牛、普通牛親緣性較近，其在物種間高度保守，與前人研究RBM3是高度保守的RNA結(jié)合蛋白的結(jié)論一致。3的核苷酸序列與其他物種相比存在差異：第51位核苷酸和與除西伯利亞虎之外的所有比對(duì)動(dòng)物都有差異，但編碼的氨基酸沒有發(fā)生改變(蘇氨酸，Thr)；第98位核苷酸也存在差異，所編碼氨基酸由參與機(jī)體糖代謝、脂肪代謝的苯丙氨酸(Phe)變?yōu)樵谥尽⒅舅嵝玛惔x和肌肉的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用的絲氨酸(Ser)，可能為牦牛3基因特點(diǎn)，需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)分別對(duì)RBM3的mRNA和蛋白在牦牛子宮、卵巢和輸卵管中相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)卵泡期、黃體期、妊娠期3個(gè)不同繁殖時(shí)期的RBM3在mRNA和蛋白層面的表達(dá)趨勢(shì)存在差異。這可能是由于3基因在本試驗(yàn)涉及到的雌性牦牛不同時(shí)期、不同部位存在翻譯和轉(zhuǎn)錄層面的調(diào)控，如磷酸化和甲基化，都對(duì)3生物學(xué)功能有重要的調(diào)節(jié)作用，由此出現(xiàn)時(shí)空表達(dá)差異。這一差異的存在為后續(xù)進(jìn)一步深入開展3生理功能和翻譯后修飾的相關(guān)研究提供了思路，有待進(jìn)一步研究。

在雌性哺乳動(dòng)物生殖過程中，卵巢作為維持雌性特征最重要的腺體器官，在生殖過程以及相關(guān)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RBM3在牦牛卵巢中的主要表達(dá)位置為卵泡顆粒層、卵泡膜以及黃體細(xì)胞，并在黃體期和妊娠期呈現(xiàn)高表達(dá)。黃體作為在卵巢內(nèi)形成的內(nèi)分泌腺體樣結(jié)構(gòu)，通過產(chǎn)生孕酮、雌激素以及其他激素來(lái)調(diào)控個(gè)體發(fā)情周期和妊娠。卵泡顆粒細(xì)胞作為參與調(diào)控原始卵泡的啟動(dòng)、發(fā)育、卵泡選擇、成熟以及排卵過程的重要角色，與卵泡膜細(xì)胞之間也存在著一定相互作用，而且這種相互作用在卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟過程中有重要意義。在卵巢中，卵泡破裂排卵后退化形成黃體，前人研究表明黃體細(xì)胞可以通過自分泌與旁分泌方式在黃體功能調(diào)節(jié)中起到局部調(diào)節(jié)作用，其中黃體期黃體通過分泌孕酮來(lái)抑制卵巢排卵、妊娠期黃體持續(xù)分泌孕酮維持妊娠。因此，RBM3在牦牛黃體期、妊娠期卵巢的高表達(dá)可能與黃體功能調(diào)節(jié)和妊娠維持有關(guān)系。

輸卵管作為動(dòng)物體內(nèi)精子獲能、受精及胚胎早期發(fā)育的場(chǎng)所。在本試驗(yàn)中，RBM3在牦牛輸卵管中的主要表達(dá)位置為黏膜上皮，黏膜上皮可以通過分泌物影響精卵結(jié)合和合子的形成，對(duì)早期胚胎的發(fā)育和轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用。從已知的研究結(jié)果來(lái)看，輸卵管在卵泡期受卵巢分泌雌激素的影響，黏膜上皮細(xì)胞快速生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，分泌輸卵管液為受精和早期胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境。卵巢排卵后，卵泡液和卵子一起進(jìn)入輸卵管，在黃體期輸卵管中卵泡液和輸卵管液的融合為精子到達(dá)受精部位提供了保障，妊娠期輸卵管變粗、伸長(zhǎng)、彎曲變多并促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RBM3在黃體期和妊娠期輸卵管的表達(dá)量顯著高于卵泡期，結(jié)合免疫組化結(jié)果推測(cè)RBM3在牦牛輸卵管中參與了生殖配子在輸卵管內(nèi)的運(yùn)行以及早期胚胎發(fā)育過程，這可能和RBM3調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的生理學(xué)功能有關(guān)。

子宮作為胎生動(dòng)物胚胎附植以及生長(zhǎng)發(fā)育的場(chǎng)所，其生長(zhǎng)發(fā)育和活動(dòng)由復(fù)雜的內(nèi)分泌系統(tǒng)所控制，并且具有重要的生理功能。在本研究中，RBM3在子宮的主要表達(dá)位置為子宮內(nèi)膜和子宮腺，而且在子宮卵泡期的表達(dá)顯著高于黃體期和妊娠期。子宮內(nèi)膜作為子宮的壁層具有促進(jìn)發(fā)情周期循環(huán)、孕育胎兒、內(nèi)分泌等作用；而子宮腺則可以分泌多種妊娠識(shí)別、胚胎著床、促進(jìn)胎兒發(fā)育的多種物質(zhì)。在卵泡期階段，子宮內(nèi)膜以增殖、生長(zhǎng)以及細(xì)胞內(nèi)代謝為主，子宮腺的分泌水平也在這一時(shí)期較高。子宮內(nèi)膜可以通過腺體產(chǎn)生的大量因子，而子宮腺通過感受激素刺激可以分泌相關(guān)因子，還可以通過分泌相關(guān)生長(zhǎng)因子控制自身的正常生理周期。這一結(jié)果可能與子宮肌的運(yùn)動(dòng)對(duì)生殖機(jī)能的影響、提供胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境、構(gòu)成胎兒發(fā)育的環(huán)境等生理功能存在聯(lián)系。因此推測(cè)，RBM3參與了雌性牦牛的子宮生理周期的調(diào)控以及妊娠識(shí)別等過程。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了牦牛3基因，登錄號(hào)為：MF142258.1，3基因ORF全長(zhǎng)為483 bp，編碼18種、160個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)RBM3蛋白存在17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是穩(wěn)定的非跨膜蛋白。RBM3蛋白及基因在雌性牦牛發(fā)情周期不同階段的卵巢、子宮、輸卵管中均有表達(dá)，但存在差異。本研究結(jié)果提示，RBM3參與了牦牛發(fā)情周期以及妊娠過程的調(diào)控。