lncRNA EPB41L4A-AS通過調(diào)控ErbB3抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的研究

劉麗華，鐘震宇，鄭玉杰，王 昕

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)在奶牛乳腺發(fā)育與泌乳中發(fā)揮著重要作用，也是乳汁合成與分泌的重要場(chǎng)所，對(duì)于乳品質(zhì)、乳成分及產(chǎn)乳量具有重要影響。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是長(zhǎng)度超過200 nt的轉(zhuǎn)錄本，具有重編程基因表達(dá)，影響細(xì)胞命運(yùn)決定，細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡和衰老等功能。

已有的研究表明，lncRNA參與乳腺發(fā)育、泌乳和乳腺炎等過程。lncRNA1缺失型小鼠的乳腺上皮細(xì)胞增殖能力下降，并導(dǎo)致小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)及泌乳功能發(fā)生退化。lncRNA使乳腺干細(xì)胞的自我更新能力增強(qiáng)，并且提高乳腺干細(xì)胞對(duì)雌激素毒性的防御能力。lncRNA1、和9等在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

PI3K-AKT信號(hào)通路對(duì)乳腺中乳脂和乳蛋白的合成、BMECs的增殖和凋亡等過程發(fā)揮重要作用。JAK-STAT信號(hào)通路中，Jak2磷酸化轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5a(STAT5a)，而STAT5a激活β-酪蛋白(Csn2)等乳蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄。ErbB3與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的PIK3R1(p85調(diào)節(jié)亞基)有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)磷酸化后，ErbB3與PIK3R1相互作用促進(jìn)PI3K的活性，激活A(yù)KT。也有研究發(fā)現(xiàn)，3敲除小鼠乳腺中表達(dá)p-STAT5a/b的aMEC(alveolar mammary epithelial cells)很少，ErbB3可能作為ErbB4的異二聚體伴侶參與了信號(hào)級(jí)聯(lián)，激活STAT5a的表達(dá)和磷酸化。

本課題組前期對(duì)荷斯坦奶牛乳腺組織的lncRNA-seq分析結(jié)果表明，lncRNA41L4A-AS(erythrocyte membrane protein band 4.1 like 4A antisense RNA)在干奶期及泌乳期差異表達(dá)，生物信息學(xué)分析表明其參與調(diào)控生長(zhǎng)因子連接及蛋白質(zhì)磷酸化等過程。因此，本研究干擾41L4A-AS后檢測(cè)其對(duì)BMECs增殖及PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響，為闡釋lncRNA調(diào)控奶牛乳腺發(fā)育與泌乳的分子機(jī)理及奶牛的分子育種等工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 BMECs培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)系由西北農(nóng)林科技大學(xué)趙辛教授實(shí)驗(yàn)室提供，用SV40大T抗原轉(zhuǎn)染BMECs獲得。BMECs在DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青-鏈霉素、5 μg·mL胰島素和1 μg·mL地塞米松)中于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至60%～70%匯合時(shí)，轉(zhuǎn)染EPB41L4A-AS siRNA(序列為5′-CTGCTTGTATGAAACTACT-3′)和NC-siRNA(廣州銳博)，培養(yǎng)箱中孵育48 h，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2 BMECs RNA核質(zhì)分離

按照細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(C510001，生工)分離BMECs細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核；Trizol 法分別提取細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)RNA。

1.3 MTT檢測(cè)BMECs活力

將BMECs按每孔5 × 10細(xì)胞接種于96孔板。轉(zhuǎn)染EPB41L4A-AS siRNA和NC-siRNA 48 h，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，添加20 μL無菌MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)后置于搖床孵育10 min，直到紫色晶體完全溶解。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 EdU檢測(cè)BMECs增殖

將BMECs按每孔5 × 10細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染EPB41L4A-AS siRNA和NC-siRNA 48 h后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(c10310-1，廣州銳博)進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Quantitative real-time PCR(qPCR)檢測(cè)BMECs中基因表達(dá)水平

TRIzol法提取組織和細(xì)胞中總RNA，使用PrimerScript RT試劑盒(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。引物采用Primer 6.0設(shè)計(jì)，由上海生工合成(表1)。反應(yīng)體系參考PerfectStartGreen qPCR SuperMix (AQ601-01，TRANS)試劑盒說明書，反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃(或最適溫度) 30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 EPB41L4A-AS等基因的qPCR引物信息Table 1 Real-time PCR primers information for EPB41L4A-AS and genes

1.6 Western blot檢測(cè)BMECs蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后，使用RIPA(radioimmunoprecipitation assay)細(xì)胞裂解液(Applygen，北京)從BMECs中提取總蛋白。利用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣品(20 μg)并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后，在4 ℃下用兔單克隆抗體ErbB3 (Abcam，1∶1 000稀釋)、鼠單克隆抗體PIK3R1(proteintech，1∶2 000稀釋)、兔多克隆抗體AKT(碧云天，1∶2 000稀釋)、鼠單克隆抗體p-AKT(proteintech，1∶2 000稀釋)和鼠單克隆抗體STAT5a(SANTA CRUZ，1∶500稀釋)，孵育過夜，然后山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG孵育(中山生物，北京)。利用ACTIN (Abcam，1∶5 000稀釋)作為內(nèi)參，通過Super ECL Plus(Apply-GEN)對(duì)蛋白條帶可視化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

qPCR結(jié)果以內(nèi)參基因-為對(duì)照，采用2的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；MTT試驗(yàn)，根據(jù)不同處理組490 nm波長(zhǎng)下OD值，分析試驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)比值；Western blot數(shù)據(jù)用軟件ImageJ進(jìn)行灰度分析，用GraphPad Prism 9 軟件對(duì)數(shù)據(jù)采用檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析并作圖。差異顯著性用*<0.05、**<0.01、***<0.001表示。

2 結(jié) 果

2.1 EPB41L4A-AS在奶牛乳腺組織中的表達(dá)

前期的測(cè)序發(fā)現(xiàn)41L4A-AS(NC-037337.1，位于奶牛10號(hào)染色體，逆向轉(zhuǎn)錄，因此將其命名為EPB41L4A-AS)在泌乳早期的表達(dá)量顯著高于干奶期，因此，通過qPCR對(duì)41L4A-AS在奶牛乳腺組織中的表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，41L4A-AS在泌乳期表達(dá)量極顯著高于干奶期(圖1a，<0.01)，與測(cè)序結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，41L4A-AS在BMECs細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，且主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖1b)。

a. EPB41L4A-AS在干奶期(CD)和泌乳期(CL)奶牛乳腺組織中的相對(duì)表達(dá)量，**P<0.01，下同。b. EPB41L4A-AS的亞細(xì)胞定位：1.細(xì)胞核；2.細(xì)胞質(zhì)；M. DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)a. Relative expression of EPB41L4A-AS in mammary gland tissue of dry (CD) and lactation (CL) stages, **P<0.01, the same as below. b. Subcellular localization of EPB41L4A-AS: 1. Nucleus; 2. Cytoplasm; M. DNA marker圖1 EPB41L4A-AS在奶牛乳腺組織中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位Fig.1 Expression and subcellular localization of EPB41L4A-AS in bovine mammary gland tissue

2.2 EPB41L4A-AS對(duì)BMECs增殖的影響

向BMECs中轉(zhuǎn)染150 nmol·LEPB41L4A-AS siRNA 48 h后，41L4A-AS的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(圖2a，<0.01)。MTT結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，降低41L4A-AS的表達(dá)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力極顯著提高(圖2b，<0.001)。EdU試驗(yàn)進(jìn)一步表明，降低41L4A-AS的表達(dá)后EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多(圖2c)，而且細(xì)胞增殖相關(guān)基因1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(圖2d，<0.05)。

a. siRNA對(duì)BMECs的干擾效率；b. siRNA對(duì)BMECs活力的影響；c. siRNA對(duì)BMECs增殖的影響; d. siRNA對(duì)BMECs中CDK1相對(duì)表達(dá)量的影響。*. P<0.05；***.P<0.001，下同a. Interference efficiency of siRNA on BMECs; b. Effect of siRNA on BMECs activity; c. Effect of siRNA on proliferation of BMECs; d. Effects of siRNA on the relative expression of CDK1 in BMECs. *. P<0.05; ***. P<0.001, the same as below圖2 EPB41L4A-AS對(duì)BMECs活力和增殖的影響Fig.2 Effects of EPB41L4A-AS on the activity and proliferation of BMECs

2.3 EPB41L4A-AS調(diào)控BMECs中ErbB3的表達(dá)

由于3基因能夠促進(jìn)乳腺的發(fā)育和分化，因此本研究在降低41L4A-AS的表達(dá)后，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分別檢測(cè)了3基因的表達(dá)量情況。qPCR結(jié)果表明，降低41L4A-AS的表達(dá)后，3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(圖3a，<0.05)，Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明，3基因在蛋白水平的表達(dá)量也極顯著增加(圖3b，<0.01)。

a.siRNA對(duì)ErbB3基因相對(duì)表達(dá)量的影響；b. siRNA對(duì)ErbB3蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響a.Effect of siRNA on relative mRNA expression of ErbB3 gene; b.Effect of siRNA on relative protein expression of ErbB3圖3 EPB41L4A-AS調(diào)控BMECs中ErbB3的表達(dá)Fig.3 EPB41L4A-AS regulates the expression of ErbB3 in BMECs

2.4 EPB41L4A-AS對(duì)BMECs中PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)控

PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路在奶牛乳腺中乳脂和乳蛋白的合成、BMECs的增殖和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，而3是它們的上游基因，因此本研究對(duì)這兩個(gè)信號(hào)通路中3R1、和5a基因也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，降低41L4A-AS的表達(dá)后，3R1、和5a基因的相對(duì)表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組(圖4a、4b和4c，<0.05)。Western blot 結(jié)果進(jìn)一步表明，PIK3R1、AKT和STAT5a在蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(圖4d、4e、4f和4g，<0.05)。由于AKT發(fā)生磷酸化后才具有活性，才可以激活下游因子進(jìn)而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，因此檢測(cè)了磷酸化AKT的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)降低41L4A-AS的表達(dá)后磷酸化AKT(p-AKT)的表達(dá)量顯著升高(圖4d和4h，<0.05)。

a～c. siRNA對(duì)PIK3R1、AKT和STAT5a基因相對(duì)表達(dá)量的影響;d～h. siRNA對(duì)PIK3R1、AKT、p-AKT和STAT5a蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響a-c. Effects of siRNA on the relative mRNA expression levels of PIK3R1, AKT and STAT5a genes; d-h. Effects of siRNA on the relative protein expression levels of PIK3R1, AKT, p-AKT and STAT5a圖4 EPB41L4A-AS對(duì)BMECs中PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路的影響Fig.4 Effects of EPB41L4A-AS on PI3K-AKT and JAK-STAT signaling pathways in BMECs

3 討 論

lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA分子，通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與乳腺的發(fā)育、泌乳和乳腺炎等過程。已有研究證明，lncRNA 可以抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖，如lncRNA1在乳腺組織中高表達(dá)，敲低lncRNA1會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞增殖，且較正常者而言，三陰性乳腺癌(TNBC)患者血液中l(wèi)ncRNA1的表達(dá)明顯下調(diào)，表明其可能是一種腫瘤抑制lncRNA。課題組前期對(duì)奶牛泌乳期和干奶期乳腺組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，41L4A-AS在泌乳早期高表達(dá)，提示41L4A-AS可能在控制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中發(fā)揮重要作用。因此，本研究首先利用qPCR技術(shù)驗(yàn)證了41L4A-AS在干奶期和泌乳期乳腺組織中相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果與測(cè)序相一致。進(jìn)一步對(duì)41L4A-AS的功能研究發(fā)現(xiàn)，降低41L4A-AS的表達(dá)后EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞活力明顯增加，表明41L4A-AS在泌乳期作為乳腺上皮細(xì)胞增殖的抑制因子，維持乳腺上皮細(xì)胞的穩(wěn)定。

已有的研究表明，3能夠促進(jìn)乳腺增生和乳腺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾EPB41L4A-AS后顯著增加了BMECs中3的相對(duì)表達(dá)量，并且促進(jìn)BMECs的增殖，這與已有的研究結(jié)果相符。3在妊娠中期乳腺中參與了PI3K/AKT和JAK-STAT信號(hào)通路，PI3K/AKT信號(hào)對(duì)于妊娠期間迅速擴(kuò)大的aMEC群體的生存是必需的，而5a信號(hào)是3下游MEC分化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。5a可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)乳蛋白合成和妊娠期乳腺上皮細(xì)胞的分化，維持乳腺上皮細(xì)胞的存活，促進(jìn)酪蛋白合成。不同的1、2和3敲除小鼠表明，對(duì)5a的激活和乳腺細(xì)胞增殖是必要的。因此，本研究干擾41L4A-AS后檢測(cè)了PI3K-AKT和JAK-STAT信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)是否受到影響，發(fā)現(xiàn)3R1、和5a基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受41L4A-AS的調(diào)控，干擾41L4A-AS表達(dá)后，顯著增加了3R1、和5a在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量。PIK3R1、AKT和STAT5a蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，且磷酸化AKT(p-AKT)蛋白的表達(dá)量也顯著升高。這些結(jié)果表明，干擾41L4A-AS表達(dá)后顯著增加了BMECs中3的相對(duì)表達(dá)量，從而促進(jìn)PI3K/AKT和JAK-STAT信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)。

有研究證明，lncRNAs能直接與信號(hào)蛋白的功能域相互作用，NF-κB可以上調(diào)lncRNA的表達(dá)量，同時(shí)與NF-κB/IκB結(jié)合，直接掩蓋了IκB的磷酸化基序，從而抑制IKK誘導(dǎo)的IκB磷酸化和NF-κB激活，影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后。在hESCs中，定位細(xì)胞質(zhì)的lncRNA結(jié)合到E3泛素連接酶β-TrCP的WD40結(jié)構(gòu)域，并阻斷其與磷酸化β-catenin的相互作用以防止降解，導(dǎo)致WNT信號(hào)通路激活，從而實(shí)現(xiàn)多能性。lncRNA與RXRA結(jié)合，通過GSK3β增加其絲氨酸49/78磷酸化，從而激活PIK3CA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路和TNBC腫瘤的發(fā)生。因此推測(cè)，41L4A-AS可能與ErbB3蛋白的功能域存在潛在的相互作用，但這需要更深入的研究證明。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，降低41L4A-AS表達(dá)后能夠促進(jìn)3的表達(dá)，激活PI3K/AKT和JAK-STAT信號(hào)通路從而促進(jìn)BMECs的增殖。