雞環(huán)狀RNA circSESN1的表達(dá)特性探究

邵冰豪，高林歌，朱星浩，張懷勇，陳 文，黃艷群

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450002)

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一種由前體mRNA在反向剪接過程中形成的非編碼RNA。circRNAs 根據(jù)來源主要分為四類：由外顯子組成的外顯子環(huán)狀RNA；由內(nèi)含子組成的內(nèi)含子環(huán)狀RNA；外顯子和內(nèi)含子共同組成的外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA；來自基因間區(qū)的基因間環(huán)狀RNA。circRNAs的分布十分廣泛，在人、動(dòng)物和植物體內(nèi)都可以檢測(cè)到。此外，circRNAs具有時(shí)空表達(dá)特性和序列保守性，并且在畜禽的各個(gè)組織器官中表達(dá)豐度不同。隨著RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)有研究報(bào)道circRNAs可以參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用，也可以結(jié)合microRNA(miRNA)進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)以及可以編碼蛋白。近年來，在雞體內(nèi)發(fā)現(xiàn)circRNAs可以參與到肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過程，例如circTMTC1通過吸附miR-128-3p抑制雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化；circHIPK3吸附miR-30a-3p從而促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖分化；circFAM188B可以編碼一種調(diào)節(jié)雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的蛋白；circSVIL通過吸附miR-203促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖和分化等。

Sestrins家族中的1、2和3三個(gè)基因廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各個(gè)組織中，且1在骨骼肌的表達(dá)量較高，在分化的肌管也高表達(dá)。Sestrins是胰島素和葡萄糖敏感型的基因，可以與GATOR2相互作用，參與mTORC1上游的氨基酸感知通路的負(fù)向調(diào)控。在小鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)，Sestrins是促進(jìn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體代謝和身體耐力產(chǎn)生好處的關(guān)鍵整合因子，運(yùn)動(dòng)后敲除1的小鼠比野生型小鼠表現(xiàn)出更高的葡萄糖不耐受。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在雞體內(nèi)miR-16-5p 通過靶向1從而抑制成肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)成肌細(xì)胞凋亡，抑制成肌細(xì)胞分化。1是53基因的主要靶點(diǎn)，下調(diào)1后可以減少自噬進(jìn)而減輕多囊卵巢綜合征。1也是一種抗氧化劑，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和損傷的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同的作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)，1基因突變型的秀麗隱桿線蟲的壽命明顯縮短，而且肌細(xì)胞會(huì)嚴(yán)重受損，肌動(dòng)蛋白纖維異常彎曲。

目前尚未見關(guān)于1的環(huán)狀RNA的相關(guān)報(bào)道。本課題組前期從肉雞和烏雞胸肌的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由1外顯子形成的circRNA(circSESN1)。本研究通過鑒定雞體內(nèi)circSESN1，預(yù)測(cè)circSESN1的潛在性功能，檢測(cè)雞circSESN1的時(shí)空表達(dá)特性，并對(duì)雞進(jìn)行胰島素、葡萄糖、丙酮酸鈉和飼糧限飼等外源性刺激探究circSESN1在雞體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控特性。為今后深入研究雞circSESN1在胰島素代謝和肌肉發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)一：取絲羽烏骨雞(烏雞)種蛋(=50)進(jìn)行孵化，在孵化期間分別挑選10胚齡(E10)和19胚齡 (E19)烏雞各4只采集胸肌組織，剩余雞胚繼續(xù)孵化，出殼后自由采食、自由飲水，飼糧配制參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，光照時(shí)間為23 h·d， 出殼后第1周雞舍溫度控制在33～35 ℃， 以后每周溫度遞減2～3 ℃。飼喂至21日齡 (21 d)時(shí)，分別挑選4只雄性烏雞，采集其心、肝、肌胃、腺胃、胸肌、腿肌、腦和胰腺8個(gè)組織樣；飼養(yǎng)至49日齡(49 d)時(shí)，挑選4只雄性烏雞，采集胸肌組織，均迅速凍于液氮后-80 ℃保存。

試驗(yàn)二：1 d艾拔益加雄性肉雞(肉雞)在相同條件下飼養(yǎng)(同試驗(yàn)一)，并分別選取40只體重相近的肉雞開展葡萄糖耐受試驗(yàn)(18 d)、丙酮酸耐受試驗(yàn)(21 d)和胰島素耐受試驗(yàn)(24 d)，試驗(yàn)前禁食12 h， 分別于試驗(yàn)前采集不做處理雞的胸肌樣品為基礎(chǔ)狀態(tài)(或0 min，=6)。①葡萄糖耐受試驗(yàn)：試驗(yàn)組按照2 g·kg的劑量腹腔注射10%葡萄糖溶液，對(duì)照組注射同等劑量的0.9%生理鹽水，分別于注射后10和60 min，采集6只雞胸肌組織樣品。②丙酮酸耐受試驗(yàn)：試驗(yàn)組按照2 g·kg的劑量腹腔注射丙酮酸鈉(用0.9%生理鹽水稀釋)，對(duì)照組注射等劑量的0.9%生理鹽水，注射后60 min采集6只雞的胸肌組織。③胰島素耐受試驗(yàn)：試驗(yàn)組按照0.05 mL·kg的劑量腹腔注射胰島素，對(duì)照組腹腔注射等劑量的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。試驗(yàn)所用胰島素用PBS進(jìn)行稀釋(胰島素∶PBS=1∶9)，在胰島素和PBS注射后15、120和240 min分別采集6只雞的胸肌組織。所有采集的樣品迅速于液氮冷凍后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

試驗(yàn)三：1 d的艾拔益加肉雞于相同條件下飼養(yǎng)，飼糧配方參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究的限飼配方。飼喂至7 d時(shí)隨機(jī)挑選30只體重相近的雌性肉雞分為3組(對(duì)照組、15%能量限飼組和15%蛋白限飼組)。對(duì)照組飼喂常規(guī)日糧，自由采食；15%能量限飼組自由采食能量限制飼糧(代謝能是對(duì)照組的85%，其它各營(yíng)養(yǎng)水平與對(duì)照組相同)；15%蛋白限飼組自由采食蛋白限制飼糧(粗蛋白質(zhì)含量是對(duì)照組的85%，其它各營(yíng)養(yǎng)水平均與對(duì)照組相同)，飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行至21 d時(shí)，每組各采集10只雞胸肌組織。采集的組織樣品迅速放于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

采用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)circSESN1剪接位點(diǎn)附近100～200 bp序列設(shè)計(jì)背靠背引物擴(kuò)增circSESN1，并設(shè)計(jì)面對(duì)面引物擴(kuò)增1(登錄號(hào)：XM_004940327.4)和-(登錄號(hào)：NM_205518.1)，引物序列見表1。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 DNA、RNA提取和RNA反轉(zhuǎn)錄

按照動(dòng)物組織基因組DNA小量提取試劑盒(萊楓，上海)說明書要求，提取21 d烏雞肝組織中的基因組DNA。采用TRIzol法提取各個(gè)組織樣品的RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量與完整性，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度以及OD 260/280 nm。參照HiScriptⅢ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(諾唯贊，南京)說明書進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄過程分為兩步，第一步首先去除基因組DNA：Total RNA 1 μg、5× gDNA wiper Mix 2 μL，用ddHO補(bǔ)充至10 μL，于42 ℃孵育 2 min。第二步合成cDNA：第一步的混合液10 μL、10× RT Mix 2 μL、HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL、Oligo(dT)VN 1 μL、 Random hexamers 1 μL、ddHO 4 μL，于37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。得到的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RNase R酶處理

將提取21 d烏雞肝組織RNA樣品分為兩份，一份參照RNase R酶試劑(吉賽，廣州)說明書進(jìn)行RNase R 酶處理(RNase R+)；另一份作為對(duì)照(RNase R-)。處理組在2 μg RNA中加入6 U RNase R酶，對(duì)照組加入等量緩沖液，于37 ℃孵30 min， 然后于70 ℃，10 min使酶失活后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 qRT-PCR

以-為內(nèi)參基因，使用熒光定量PCR儀(Light Cycler96，美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR，qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)包括：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL(諾唯贊，南京)，加ddHO補(bǔ)充體系至10 μL， 反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。在qRT-PCR試驗(yàn)中均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置不添加cDNA的組別為陰性對(duì)照。采用2法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 潛在性功能預(yù)測(cè)

通過miRanda軟件預(yù)測(cè)剪切后的circSESN1和miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。用Cytoscape軟件構(gòu)建circSESN1-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)。利用IRESfinder軟件，尋找circSESN1序列上是否包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)信息，分析circSESN1是否具備不依賴5′帽子結(jié)構(gòu)而啟動(dòng)翻譯的功能，從而對(duì)circSESN1的蛋白翻譯潛能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0的單因素方差分析和鄧肯法多重比較對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。使用GraphPad Prism 8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 circSESN1的鑒定和成環(huán)驗(yàn)證

高通量測(cè)序獲得的circSESN1是由1三個(gè)外顯子(XM_004940327.4，位置：510～1 136 bp)反向 剪切形成的環(huán)狀RNA，總長(zhǎng)627 bp。為了對(duì)circSESN1進(jìn)行鑒定和成環(huán)驗(yàn)證，利用試驗(yàn)一采集的21 d烏雞肝組織，根據(jù)表1的引物信息，對(duì)circSESN1和來源基因1進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增(圖1A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以cDNA為模板時(shí)可以同時(shí)檢測(cè)到circSESN1和1的表達(dá)，但以gDNA為模板時(shí)僅可檢測(cè)到1的表達(dá)，而不能檢測(cè)到circSESN1的表達(dá)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序后發(fā)現(xiàn)circSESN1連接處的測(cè)序結(jié)果和高通量測(cè)序結(jié)果相符(圖1B)，與1外顯子反向連接處的序列也一致。從而表明circSESN1是反向剪切成環(huán)存在的。對(duì)circSESN1與1的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)(圖1C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用RNase R酶處理后，與對(duì)照組相比，線性基因-和1表達(dá)量均發(fā)生了極顯著的降低(<0.01)，而RNase R酶處理后circSESN1的表達(dá)與對(duì)照組相比差異不顯著(>0.05)， 表明circSESN1能夠耐受RNase R酶的消化，對(duì)于RNase R酶具有較強(qiáng)的抵抗性，也再次證明了circSESN1是以環(huán)狀形式真實(shí)存在的。

A. circSESN1與來源基因SESN1分別以cDNA和gDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，白色三角形表示circSESN1背對(duì)背引物，黑色三角形表示來源基因SESN1面對(duì)面引物；B. circSESN1連接位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證；C. circSESN1和SESN1的穩(wěn)定性檢測(cè)。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，ns表示P>0.05。下同A. circSESN1 and source gene SESN1 were amplified by RT-PCR using cDNA and gDNA as templates, respectively. The white triangle represents the divergent primer of circSESN1, and the black triangle indicates the convergent primer of the source gene SESN1. B. Sanger sequencing verification of circSESN1 junction site. C. Stability detection of circSESN1 and SESN1. * means P < 0.05, ** means P < 0.01, ns means P>0.05. The same as below圖1 circSESN1的鑒定和成環(huán)驗(yàn)證Fig.1 Identification and cycling verification of circSESN1

2.2 circSESN1組織表達(dá)特性

為了探究circSESN1的組織表達(dá)特性，通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了circSESN1和來源基因1在烏雞各個(gè)組織中的表達(dá)量(圖2A、2B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circSESN1和其來源基因1具有相似的組織表達(dá)模式，在骨骼肌和胰腺中高表達(dá)，在其它組織中低表達(dá)。circSESN1在胸肌中的表達(dá)極顯著高于其它幾個(gè)組織(<0.01)，腿肌和胰腺中circSESN1的表達(dá)極顯著高于心、肝、肌胃、腺胃和腦(<0.01)，而circSESN1在心、肝、肌胃、腺胃和大腦的表達(dá)無顯著差異(>0.05)。來源基因1在胸肌的表達(dá)也極顯著高于其它幾個(gè)組織(<0.01)；此外在腿肌和胰腺中1的表達(dá)極顯著高于肝、肌胃、腺胃和腦(<0.01)。進(jìn)一步對(duì)雞不同發(fā)育階段的胸肌中circSESN1和1的表達(dá)特性進(jìn)行分析(圖2C、2D)，發(fā)現(xiàn)circSESN1和其來源基因1隨雞的生長(zhǎng)發(fā)育表現(xiàn)了相似的變化趨勢(shì)，以胚胎發(fā)育(E10)早期最低，而在胚胎發(fā)育后期和出生后保持相對(duì)高的表達(dá)。circSESN1在21 d雞胸肌中的表達(dá)量最高，極顯著高于E10、E19和49 d胸肌中的表達(dá)量(<001)，大約是E10胸肌中表達(dá)量的450倍。而1在E19胸肌中表達(dá)量高于E10、21和49 d胸肌中的表達(dá)量，與E10胸肌中的表達(dá)量相比大約提高了20倍。

A. circSESN1在21 d烏雞組織表達(dá)譜；B. 來源基因SESN1在21 d烏雞組織表達(dá)譜；C. circSESN1在雞不同發(fā)育階段胸肌中的表達(dá)；D. SESN1在雞不同發(fā)育階段胸肌中的表達(dá)。不同大寫字母表示基因在不同組織或時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示基因在不同組織或時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.05)，相同字母表示基因在不同組織或時(shí)間點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)A. The tissue expression profile of circSESN1 on 21 d in silky fowl. B. The tissue expression profile of source gene SESN1 on 21 d in silky fowl. C. The expression of circSESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. D. The expression of SESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. Different capital letters indicated extremely significant differences in genes at different tissues or time points (P<0.01). Different lowercase letters indicate significant differences in genes at different tissues or time points (P<0.05). Same letter means no significant difference in gene expression at different tissues or time points (P>0.05)圖2 circSESN1與來源基因SESN1的組織表達(dá)特性Fig.2 Tissue expression characteristics of circSESN1 and source gene SESN1

2.3 胰島素、葡萄糖和丙酮酸鈉對(duì)circSESN1表達(dá)的影響

為了探究外源性刺激對(duì)circSESN1表達(dá)的影響，首先檢測(cè)了胰島素注射對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的效應(yīng)(圖3A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，胸肌中circSESN1的表達(dá)量在胰島素注射后不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出了較大的變化，尤其是在胰島素注射120 min后表達(dá)量最高。與0 min相比，在胰島素注射120 min后circSESN1的表達(dá)量發(fā)生了極顯著升高(<0.01)，同時(shí)與注射PBS 120 min后相比也發(fā)生了極顯著升高(<0.01)。與0 min基礎(chǔ)狀態(tài)相比，在PBS注射后120 min后circSESN1的表達(dá)發(fā)生了低幅度的升高(<0.05)。使用丙酮酸鈉處理后發(fā)現(xiàn)胸肌中circSESN1在注射后60 min與基礎(chǔ)狀態(tài)相比沒有發(fā)生顯著性變化(>0.05)，與注射生理鹽水的對(duì)照組相比也沒有發(fā)生顯著性變化(圖3B)。同樣注射葡萄糖不同時(shí)間點(diǎn)后circSESN1的表達(dá)量沒有顯著性變化(>0.05，圖3C)，與注射生理鹽水的對(duì)照組相比也沒有發(fā)生顯著性變化(>0.05)。

A. 胰島素處理后對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的影響；B. 丙酮酸鈉處理后對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的影響；C. 葡萄糖處理后對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的影響A. Effect of insulin treatment on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effect of sodium pyruvate treatment on circSESN1 expression in pectoralis. C. Effect of glucose treatment on circSESN1 expression in pectoralis圖3 注射胰島素、丙酮酸鈉和葡萄糖對(duì)circSESN1表達(dá)的影響Fig.3 Effects of insulin, sodium pyruvate and glucose injection on circSESN1 expression

2.4 限飼對(duì)circSESN1表達(dá)的影響

利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的限飼群體，進(jìn)一步研究了15%能量限飼和15%蛋白限飼對(duì)circSESN1表達(dá)的效應(yīng)(圖4)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，15%能量限飼顯著下調(diào)了胸肌中circSESN1的表達(dá)(<0.05，圖4A)，大約降低了五分之四。15%蛋白限飼處理后與對(duì)照組相比胸肌中circSESN1的表達(dá)也發(fā)生了顯著性降低(<0.05，圖4B)，下調(diào)了二分之一左右。

A. 15%能量限飼對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的影響；B. 15%蛋白限飼對(duì)胸肌中circSESN1表達(dá)的影響A. Effect of 15% energy restriction on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effects of 15% protein restriction on circSESN1 expression in pectoralis圖4 限飼對(duì)肉雞胸肌circSESN1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of feeding restriction on circSESN1 expression in pectoralis of broilers

2.5 circSESN1-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)

為了研究circSESN1的功能，對(duì)circSESN1的靶向miRNAs進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circSESN1可以和71個(gè)miRNAs發(fā)生互作(圖5)，提示circSESN1可能通過結(jié)合miRNA進(jìn)而發(fā)揮作用。

圖5 circSESN1-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 circSESN1-miRNA interaction network

2.6 circSESN1翻譯蛋白的潛能分析

對(duì)circSESN1序列中的IRES信息進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circSESN1序列上和剪接位點(diǎn)都不存在IRES，評(píng)分都在0.5以下(表2)，說明circSESN1不存在潛在的翻譯蛋白能力，而是作為非編碼RNA行使功能。

表2 circSESN1翻譯蛋白潛能分析Table 2 The analysis of protein-coding ability of circSESN1

3 討 論

circRNAs由于結(jié)構(gòu)的特殊性，需要對(duì)其進(jìn)行鑒定是否成環(huán)。根據(jù)circRNAs反向剪接處的序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的背對(duì)背引物和面對(duì)面引物，并檢測(cè)以cDNA和gDNA為模板時(shí)能否通過PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。面對(duì)面引物在cDNA和gDNA中均能檢測(cè)出相應(yīng)的目的條帶，而背對(duì)背引物只在cDNA模板中檢測(cè)出相應(yīng)的目的條帶，在gDNA中檢測(cè)不到。與線性基因相比，circRNAs由于不具備5′端和3′端的結(jié)構(gòu)，所以具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性不易被RNase R酶消化。本研究通過使用RNase R酶進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)circSESN1的表達(dá)確實(shí)不受RNase R酶的影響。從而證明了circSESN1是反向成環(huán)并真實(shí)存在的。

已有文獻(xiàn)報(bào)道circRNAs可正向調(diào)控來源基因發(fā)揮功能，如敲低circEIF3 J和circPAIP2后分別導(dǎo)致HeLa和HEK293細(xì)胞中來源基因mRNA水平的下降；在食管鱗狀細(xì)胞癌中，circITCH作為miRNA海綿從而促進(jìn)miRNA靶基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，circSESN1和來源基因1具有相似的時(shí)空表達(dá)模式，提示circSESN1和來源基因1在胸肌中可能存在潛在的協(xié)同作用。circSESN1-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，circSESN1具有豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)circSESN1可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，通過堿基互補(bǔ)海綿吸附miRNA的方式調(diào)控1的表達(dá)。在這些存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs中，miR-184和miR-17已報(bào)道與胰島素代謝有關(guān)，這也預(yù)示著circSESN1可能通過與這些miRNAs互作進(jìn)而調(diào)節(jié)雞體內(nèi)胰島素的代謝。circSESN1和其來源基因1均在骨骼肌中高表達(dá)，提示其在肌肉發(fā)育上的潛在功能。有研究表明，出殼前雞胚的肌肉發(fā)育主要源于肌纖維數(shù)目的增加，而出殼后肌肉的增加是來源于肌纖維細(xì)胞的肥大。本研究發(fā)現(xiàn)，circSESN1和其來源基因1在胚胎發(fā)育早期(E10)胸肌中低表達(dá)，而在胚胎后期(E19)、21和49 d中高表達(dá)，也提示其與雞骨骼肌在胚胎后期和出殼后的高速生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，且已有研究發(fā)現(xiàn)1可促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖，抑制成肌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化。

胰島素是維持機(jī)體血糖平衡、供給各種組織和器官能量的一類重要激素。circRNAs可以參與胰島素代謝調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA Cdr1as通過miR-7及其靶點(diǎn)調(diào)控胰島細(xì)胞的胰島素分泌，也有研究在果蠅體內(nèi)鑒定到胰島素敏感型環(huán)狀RNA。此外，3可通過mTORC2激活A(yù)KT信號(hào)通路，從而增強(qiáng)小鼠肝的胰島素敏感性；同時(shí)敲減2和3也會(huì)引起肝mTORC1-S6K信號(hào)通路的激活和胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)，circSESN1和其來源基因1均在胰腺組織高表達(dá)，且外源胰島素顯著上調(diào)了雞胸肌circSESN1(120 min)的表達(dá)量。推測(cè)1及其形成的circSESN1可能通過影響胰島素的分泌從而參與雞體內(nèi)的胰島素信號(hào)調(diào)控。胰島素可促進(jìn)肌肉葡萄糖的吸收，肌肉葡萄糖可通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，而丙酮酸可通過糖異生轉(zhuǎn)化為葡萄糖，本研究發(fā)現(xiàn)肌肉中circSESN1的表達(dá)既非丙酮酸敏感型，也非葡萄糖敏感型的，而是胰島素敏感型的。此外有研究發(fā)現(xiàn)，在丙酮酸鈉和葡萄糖注射30 min后血糖濃度變化幅度最大，在60 min的變化不大，這也能進(jìn)一步解釋本試驗(yàn)中注射葡萄糖和丙酮酸鈉60 min后，circSESN1的表達(dá)量雖然發(fā)生了變化但是差異不顯著。本課題組前期的研究還發(fā)現(xiàn)，在胰島素注射后120 min內(nèi)肉雞血糖濃度呈線性下降，并在120 min時(shí)降低至最低點(diǎn)。本研究中胰島素注射后胸肌中circSESN1表達(dá)呈現(xiàn)出和血糖相反的變化規(guī)律，提示雞胸肌circSESN1通過胰島素信號(hào)通路對(duì)血糖濃度進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。

限飼會(huì)影響雞體內(nèi)糖代謝。石秀文發(fā)現(xiàn)，限飼可以提高肉雞的空腹血糖。在雞線粒體中限飼可以通過改變基因的表達(dá)進(jìn)而降低線粒體DNA拷貝數(shù)。本研究中，15%能量限飼和15%蛋白限飼均顯示了和外源胰島素相反的效應(yīng)，下調(diào)了胸肌中circSESN1的表達(dá)。Sestrins家族可以通過P53、MAPK、AKT和mTOR等信號(hào)通路參與到應(yīng)激和自噬等機(jī)體調(diào)控。其中2和3通過AKT和mTOR參與到葡萄糖代謝和胰島素抵抗過程。因此推測(cè)，限飼會(huì)通過影響相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而降低circSESN1的表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究鑒定了雞體內(nèi)存在一個(gè)不被RNase R酶消化降解、具有高度穩(wěn)定性的circSESN1，并預(yù)測(cè)circSESN1存在多個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)。circSESN1和其來源基因1呈現(xiàn)了相似的時(shí)空表達(dá)特性，均在骨骼肌和胰腺組織具有較高的表達(dá)豐度，其表達(dá)也均在雞胚胎發(fā)育后期(E19)的胸肌中急劇上升。注射外源胰島素顯著上調(diào)胸肌中circSESN1(120 min)的表達(dá)，15%能量限飼和15%蛋白限飼均可顯著下調(diào)胸肌中的circSESN1的表達(dá)。