Kruppel 樣因子15對(duì)和盈黑雞前體脂肪細(xì)胞增殖分化的影響

陳 蘭，張 濤，丁 浩，謝愷舟*，張跟喜，王金玉

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院(比較醫(yī)學(xué)研究院)，揚(yáng)州 225009； 2. 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3. 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

家雞()是一種廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和基因組學(xué)研究的重要模式生物，是人類高質(zhì)量膳食蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。幾十年來(lái)經(jīng)過(guò)遺傳選育，使商品化肉雞的生長(zhǎng)速度和飼料效率顯著提高。然而，由于對(duì)肉雞高生長(zhǎng)速度的過(guò)度追求，導(dǎo)致現(xiàn)代肉雞品種出現(xiàn)了腹部脂肪過(guò)度沉積的現(xiàn)象。腹部脂肪沉積過(guò)多既浪費(fèi)日糧能量，還引起生產(chǎn)性能下降、蛋雞繁殖性能減弱等問(wèn)題，影響家禽產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。因此，控制腹部脂肪過(guò)度沉積已成為目前肉雞育種工作的主要目標(biāo)之一。

Kruppel 樣因子15(Kruppel-like factor 15，15)基因是Uchida等首次從人的腎cDNA文庫(kù)中獲得的，是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，位于雞的12號(hào)染色體上，在其羧基端具有3個(gè)CH鋅指結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別并結(jié)合富含GC的DNA序列。研究發(fā)現(xiàn)，腹部脂肪沉積受多種遺傳因素調(diào)控，而KLF家族在脂肪生成過(guò)程中起著重要作用，脂肪形成受內(nèi)部等級(jí)調(diào)節(jié)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，15能夠調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞葡萄糖和脂肪酸之間的燃料轉(zhuǎn)換，參與調(diào)控哺乳動(dòng)物脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積，還與膿毒癥、膠質(zhì)瘤、肺腺癌、心房顫動(dòng)等疾病治療和預(yù)后密切相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)，15基因可能參與調(diào)控雞脂肪沉積。研究表明，游離脂肪酸通過(guò)4抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞15的表達(dá)和葡萄糖消耗。另外，通過(guò)siRNA干擾15基因，能夠抑制豬前體脂肪細(xì)胞脂滴的形成，從而調(diào)控脂肪沉積。目前，關(guān)于15功能研究多集中在鼠、豬、牛等哺乳動(dòng)物，在家禽上鮮有報(bào)道。本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)和盈黑雞15基因的組織表達(dá)譜及其在不同發(fā)育時(shí)期腹脂組織中的時(shí)序表達(dá)模式；利用siRNA技術(shù)干擾15，檢測(cè)前體脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化，分別從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等角度研究15對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化的影響，為進(jìn)一步揭示15在雞脂肪沉積過(guò)程中發(fā)揮的功能及調(diào)控機(jī)理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為和盈黑雞，飼養(yǎng)于江蘇和盈家禽育種科技有限公司，分別隨機(jī)選取相同環(huán)境下飼養(yǎng)的和盈黑雞0(出殼第1天)、4、8、12和16周齡的健康公、母雞各4只，分別采集心、肝、脾、肺、胸肌、腿肌和腹脂組織。樣本放入裝有RNA wait樣品保存液(天根，中國(guó))的無(wú)酶EP管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，待提取總RNA。

選取5只10日齡左右的和盈黑雞母雞，無(wú)菌狀態(tài)下采集腹部脂肪組織用于原代前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)試劑

TRIzol購(gòu)自Invitrogen(中國(guó)香港)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；I型膠原蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；Cell Counting Kit-8(Dojindo，日本)、EDU試劑盒(銳博生物，中國(guó))、磷酸鹽緩沖液、青霉素/鏈霉素溶液、DMEM/F12培養(yǎng)基、Triton X-100、4%多聚甲醛、油酸和油紅O染色試劑盒均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 組織RNA的提取 本試驗(yàn)采用TRIzol法提取組織總RNA，通過(guò)NanoDrop-2000c測(cè)定總RNA的質(zhì)量(OD值在1.8～2.0之間為合格)和濃度。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上的原雞15序列(XM_025154676.1)、序列(NM_001031459. 1)和序列(XGAM_015292933. 2)，使用Primer Premier 5軟件跨內(nèi)含子各設(shè)計(jì)1對(duì)RT-qPCR引物，以-(NC_052545.1)作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物序列參照張濤等的研究，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 熒光定量引物Table 1 The primers sequences of real-time PCR

1.3.3 cDNA合成及RT-qPCR檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用諾唯贊生物科技有限公司的兩步法試劑盒進(jìn)行，總體系為20 μL：第一步添加RNA模板1 μg，gDNA wiper Mix 4 μL, RNA-Free ddHO補(bǔ)足至16 μL，吹打混勻，42 ℃ 孵育2 min；第二步，在第一步反應(yīng)液中加入qRT Super Mix 4 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，得到cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-qPCR反應(yīng)采用諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green染料法熒光定量試劑進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為： cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL， Master Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，RNA-Free ddHO補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)數(shù)進(jìn)行信息采集。

1.3.4 和盈黑雞原代前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng) 雞前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法主要采用酶消化法，具體操作步驟：隨機(jī)選擇7～10日齡(7-10 d)的和盈黑雞母雞5只，頸靜脈放血，在 75%乙醇中潤(rùn)洗消毒，然后收集腹部脂肪組織，置于60 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)浸洗3～5遍。將脂肪組織剪碎，按1∶3移入裝有Ⅰ型膠原蛋白酶消化液離心管中，37 ℃水浴，消化95 min，使其充分接觸消化。待消化完全(一般呈黏膠狀)，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，然后分別用200和400目的細(xì)胞過(guò)濾篩依次過(guò)濾，收集濾液于無(wú)菌離心管中，500×離心10 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃， 5%的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，每隔48 h換液1次。

1.3.5 和盈黑雞原代前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 雞原代前體脂肪細(xì)胞在60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖密度達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代試驗(yàn)，將細(xì)胞懸液接種12孔培養(yǎng)板，置于含5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至完全融合時(shí)，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有160 μmol·L油酸濃度的培養(yǎng)基)，每48 h更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基1次，直至144 h分化完全。分別在誘導(dǎo)12、48、96、144 h時(shí)油紅O染色后觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，然后加入異丙醇萃取分析甘油三酯含量，每組各3個(gè)重復(fù)，收集的細(xì)胞樣品置于-80 ℃冰箱保存，待RNA提取。

1.3.6 EdU檢測(cè) 將原代前體脂肪細(xì)胞接種于12孔板培養(yǎng)，使用jetPRIME polyplus轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染siR-15和siR-NC后，利用EdU Cell Proliferation Detection Kit (Ribobio, 廣州, 中國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定染色，倒置熒光顯微鏡觀察拍照，并用ImagePro Plus 6.0(Media Cybernetics, Maryland, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.7 CCK-8檢測(cè) 將原代前體脂肪細(xì)胞接種96孔板培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)染siR-15和siR-NC，每組8個(gè)重復(fù)，使用cell Counting Kit-8 cell Counting Kit (Dojindo, Kumamoto, 日本)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，通過(guò)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher, Platinum Elmer, 德國(guó))測(cè)定不同時(shí)期(12、24、36和48 h)的450 nm吸光值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.3.8 油紅O染色及甘油三酯含量測(cè)定 油紅O既是脂溶劑也是染脂劑，待細(xì)胞誘導(dǎo)分化12、48、96、144 h，分別固定、染色，具體操作參照油紅O染色試劑盒(Solarbio，北京，中國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。染色完畢，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。隨后在培養(yǎng)板中加入200 μL異丙醇萃取10～15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定510 nm的吸光值分析甘油三酯含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用2法進(jìn)行處理分析，組織表達(dá)分布計(jì)算公式為：ΔCt=Ct-Ct，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt；表達(dá)規(guī)律計(jì)算公式為：ΔCt=Ct-Ct，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt。其中，Ct(初始循環(huán)數(shù))為熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。使用SPSS20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，<0.05(*)或< 0.01(**)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增

利用已設(shè)計(jì)好的15、、、和-的引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，得到的條帶與目的條帶一致，分別為189、138、155、196和169 bp，條帶長(zhǎng)度與預(yù)期相符，清晰無(wú)拖尾，表明引物特異性良好，cDNA模板完整性好。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～3. KLF15擴(kuò)增的產(chǎn)物；4～6. PPARγ擴(kuò)增產(chǎn)物；7～9. β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物；10～12. C/EBPa擴(kuò)增產(chǎn)物;13～14. FAS擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL500 DNA Marker; 1-3. Amplification products of KLF15; 4-6. Amplification products of PPARγ; 7-9. Amplification products of β-actin; 10-12. Amplification products of C/EBPa;13-14. Amplification products of FAS圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 和盈黑雞KLF15基因表達(dá)分析

為了獲得15的組織表達(dá)分布和在脂肪組織中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)15在和盈黑雞不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，15在和盈黑雞中呈現(xiàn)多組織廣泛表達(dá)的特性，在公雞肺、胸肌、肝、腹脂和腿肌均有較高的表達(dá)量，且極顯著高于其它組織(<0.01)，在母雞胸肌組織中表達(dá)量最高，其次是腹脂組織，顯著高于肝、心、腿肌和腎組織 (<0.05)，極顯著高于肺和脾組織(<0.01)(圖2)；分別選取1日齡及4、8、12和16周齡公、母雞各3只，采集腹脂組織繪制不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，15在公、母雞腹脂中分別呈“L”和“U”表達(dá)趨勢(shì)，表達(dá)高峰均出現(xiàn)在1日齡，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的不斷進(jìn)行公雞在4周齡時(shí)表達(dá)量最低，然后緩慢上升；母雞到達(dá)12周齡時(shí)最低，然后上升(圖3)。

圖中不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)；內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，n=3Different capital letters indicated highly significant differences (P<0.01), different lowercase letters showed significant differences (P<0.05).Internal reference gene is β-actin, n=3圖2 KLF15在公雞(A)和母雞(B)不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression of KLF15 in different tissues of male (A) and female (B) chickens

圖3 KLF15在和盈黑雞公雞(A)和母雞(B)脂肪組織不同階段的表達(dá)規(guī)律Fig.3 The expression patterns of KLF15 in abdominal fat of male (A) and female (B) Heying Black chickens at different growth stages

2.3 KLF15基因?qū)﹄u前體脂肪細(xì)胞分化的影響

利用油酸誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化12、48、96、144 h 時(shí)使用油紅O對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并拍照觀察。每孔加入異丙醇萃取，酶標(biāo)儀測(cè)定510 nm吸光值，分析TG含量，同時(shí)檢測(cè)分化不同時(shí)期15 mRNA水平。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，細(xì)胞形態(tài)隨之變化，在分化12 h時(shí)，細(xì)胞輪廓清晰，48 h胞內(nèi)出現(xiàn)少量黃色小脂滴，96 h可見(jiàn)橙色大小不一的脂滴，144 h細(xì)胞輪廓模糊，呈現(xiàn)紅色片狀脂滴；TG含量分析發(fā)現(xiàn)，隨著分化的進(jìn)行TG含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，分化144 h時(shí)TG含量最高，顯著高于96 h(<0.05)，極顯著高于48和12 h(<0.01)，15 mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與之一致，在誘導(dǎo)成脂的前期15 mRNA呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，分化144 h表達(dá)量達(dá)高峰(圖4)。

A、B、C、D.誘導(dǎo)分化12、48、96和144 h的細(xì)胞(100×)；E. 脂肪細(xì)胞分化不同時(shí)期TG含量；F. KLF15在分化不同時(shí)期的表達(dá)譜。*.差異顯著(P<0.05)，**.差異極顯著(P<0.01)，下同A, B, C, D. The preadipocytes induced for 12, 48, 96 and 144 h, respectively (100×); E. TG content in adipocytes at different stages of differentiation; F. Expression profile of KLF15 at different stages of differentiation. *.The significant difference (P<0.05), * *. The extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖4 KLF15對(duì)和盈黑雞原代前體脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.4 Effects of KLF15 on preadipocyte differentiation of primary precursor of Heying Black chickens

2.4 干擾KLF15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8檢測(cè)干擾15基因后對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響。如圖5所示，干擾15基因顯著抑制了細(xì)胞增殖，24 h 干擾組OD值顯著低于對(duì)照組(<0.05)，36～48 h極顯著低于對(duì)照組(<0.01)。

圖5 CCK-8檢測(cè)干擾KLF15對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of interfering with KLF15 on cell proliferation using CCK-8 detection

采用EdU細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)干擾15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞增殖的影響，EdU檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，增殖細(xì)胞標(biāo)記為紅色熒光，干擾15基因后，極顯著抑制了細(xì)胞增殖，紅色熒光細(xì)胞占藍(lán)色熒光細(xì)胞的比例明顯降低，ImagePro Plus 6.0分析發(fā)現(xiàn)干擾組細(xì)胞比例極顯著低于對(duì)照組(<0.01)，表明干擾15基因后前體脂肪細(xì)胞增殖受到抑制。

圖6 在雞前體脂肪細(xì)胞中干擾KLF15后EdU檢測(cè)結(jié)果Fig.6 EdU detection results of interfering with KLF15 in chicken preadipocytes

2.5 干擾KLF15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞分化的影響

2.5.1 干擾15基因?qū)Ψ只瘶?biāo)記基因表達(dá)的影響 為研究15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)干擾15基因后前體脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因、和的表達(dá)變化。結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組相比，干擾組、和的表達(dá)均被抑制，其中干擾組、表達(dá)極顯著低于對(duì)照組(<0.01)，表達(dá)顯著低于對(duì)照組(<0.05)。

圖7 在前體脂肪細(xì)胞中干擾KLF15對(duì)分化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of interfering with KLF15 on the expression of differentiation-related genes in chicken preadipocytes

2.5.2 干擾15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞成脂分化的影響 在前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化第6天時(shí)，利用油紅O試劑盒染色后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果如圖8所示，干擾組紅色脂滴數(shù)量顯著少于對(duì)照組，甘油三酯含量測(cè)定分析結(jié)果表明，干擾組TG含量極顯著低于對(duì)照組(<0.01)，結(jié)果與油紅O染色的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相符。綜上所述，干擾15基因后，明顯抑制了和盈黑雞原代前體脂肪細(xì)胞的成脂分化。

圖8 干擾KLF15基因?qū)η绑w脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.8 The effect of interfering with KLF15 on preadipocyte differentiation

3 討 論

15基因是KLFs家族成員之一，具有廣泛的生物學(xué)功能。15通過(guò)調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4的表達(dá)在脂肪組織和肌肉組織的代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。脂肪形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及許多不同的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的整合。研究表明，該家族已有多個(gè)成員可能參與脂肪細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，15基因在雞前體脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中差異表達(dá)，推測(cè)其可能參與調(diào)控雞脂肪沉積。因此，本研究首先通過(guò)RT-qPCR技術(shù)對(duì)15在和盈黑雞各組織中的表達(dá)分布及在脂肪組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，15在8個(gè)被測(cè)組織中呈現(xiàn)廣泛表達(dá)的特性。在公雞的肺、胸肌、肝、腹脂和腿肌的表達(dá)量極顯著的高于其它組織(<0.01)，母雞中胸肌組織表達(dá)量最高，其次是腹脂組織顯著高于其它組織(<0.05)，而在脾組織中表達(dá)量最低。本結(jié)果與王英明等的研究結(jié)果存在相似之處，該研究顯示15同樣在肺中表達(dá)最高，腎組織中表達(dá)最低。而郭紅芳在牛上的研究與本研究結(jié)果相反，15基因在牛腎、肝和脂肪組織中均高表達(dá)，肺中表達(dá)量最低。表明15的表達(dá)存在物種特異性。發(fā)育性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，15在公、母雞的表達(dá)分別呈現(xiàn)“L”型和“U”型趨勢(shì)，表達(dá)量最高峰均出現(xiàn)在1日齡時(shí)，隨后下降。表明15在生長(zhǎng)發(fā)育初期高表達(dá)。本研究通過(guò)檢測(cè)15在體外培養(yǎng)和盈黑雞前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)差異來(lái)進(jìn)一步明確15在機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)模式。在分化的12 h時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始融合，表達(dá)量相對(duì)較低，48 h胞內(nèi)開(kāi)始分化小脂滴，表達(dá)開(kāi)始緩慢上升，96 h細(xì)胞形態(tài)模糊，脂滴明顯增多，表達(dá)量顯著上升，144 h已分化完全形成紅色大脂滴，表達(dá)量達(dá)高峰，此時(shí)TG含量最高，顯著或極顯著高于96、48和12 h。表明15在和盈黑雞前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

研究明確了干擾15能夠抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖，本研究檢測(cè)了在前體脂肪細(xì)胞中干擾15對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾15后，細(xì)胞增殖能力開(kāi)始下降，在培養(yǎng)24、36和48 h細(xì)胞增殖水平顯著或極顯著低于對(duì)照組。同時(shí)，EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果與之一致。

研究闡明干擾15在和盈黑雞原代前體脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的調(diào)控作用，本研究利用siRNA干擾15表達(dá)。發(fā)現(xiàn)干擾15后，和盈黑雞前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量明顯減少并變小，TG含量極顯著降低(<0.01)，表明15可能是前體脂肪細(xì)胞的正調(diào)控因子。Chai等研究報(bào)道，15參與前脂肪細(xì)胞的分化，與甘油三酯含量呈正相關(guān)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在豬脂質(zhì)沉積過(guò)程中敲低15的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致甘油三酯水平顯著降低(<0.05)；Mori等在3T3-L1細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)15基因能夠顯著促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞脂滴的形成，表明15在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著積極的作用。本研究中，干擾15基因后、等分化標(biāo)志基因的表達(dá)水平顯著降低(<0.01)。PPARγ是成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，能夠調(diào)控脂肪細(xì)胞表型基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。C/EBPa是C/EBPs家族中的一員，與相互協(xié)同，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，在牛前體脂肪細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)15后成脂標(biāo)志基因和顯著上調(diào)，而干擾15后成脂標(biāo)志基因顯著下調(diào)，表明15在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮正向調(diào)控作用。高欣研究發(fā)現(xiàn)，豬腎細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染15轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著上調(diào)成脂關(guān)鍵因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)沉積。脂肪酸合成酶(FAS)是催化脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。前期的研究表明，在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾15后前體脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因、和的表達(dá)水平明顯下降。因此推測(cè)，干擾15可能是通過(guò)下調(diào)分化標(biāo)志基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)前體脂肪細(xì)胞的分化成脂，但15具體的調(diào)控機(jī)理待更深層的研究證明。

4 結(jié) 論

本研究成功繪制了和盈黑雞15在多組織分布表達(dá)譜、脂肪組織時(shí)空表達(dá)譜及成脂分化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)15多組織廣泛表達(dá)的特性，其在腹脂組織中表達(dá)量相對(duì)較高。在細(xì)胞分化過(guò)程中15呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在分化后期達(dá)到高峰。干擾15能夠顯著抑制細(xì)胞增殖分化。推測(cè)其在前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中為正調(diào)控因子，可能通過(guò)調(diào)控分化標(biāo)志基因、和的表達(dá)抑制細(xì)胞成脂分化。然而，關(guān)于進(jìn)一步闡明15影響前體脂肪細(xì)胞增殖分化的機(jī)制還需深入研究，有望為肥胖治療開(kāi)辟新的思路和途徑。