北京黑豬DKK3和CCR1基因多態(tài)性檢測及其與背膘厚的關(guān)聯(lián)分析

田威龍，蘭干球， 張龍超， 王立賢， 梁 晶*， 劉 欣*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

自約9 000年前被馴化以來，豬在人類生存中發(fā)揮了重要作用。豬作為一種農(nóng)業(yè)動(dòng)物，是人類主要的肉類蛋白來源。事實(shí)上，截至2018年，豬肉已經(jīng)成為世界上消費(fèi)最多的肉類。然而，豬不僅被用作食用肉類，由于它們?cè)诮馄蕦W(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上與人類相似，并且脂肪沉積水平很高，因此豬是用于研究人類肥胖和能量代謝的合適模型。此外，脂肪沉積是一項(xiàng)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，它與胴體質(zhì)量、肉質(zhì)和消費(fèi)者的適口性相關(guān)，而背膘厚是脂肪沉積的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，豬的背膘厚性狀一直是研究的熱點(diǎn)。Yang等對(duì)1 200頭約克夏和長白豬的345 570個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行了單標(biāo)記回歸分析，以確定與背膘厚相關(guān)的SNPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSC12:46226580、SSC6:149876737和SSC8:54567459等13個(gè)顯著的SNPs與背膘厚有關(guān)。Gozalo-Marcilla等通過對(duì)8個(gè)具有不同遺傳背景的豬進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4R、23和等27個(gè)基因組區(qū)域的264個(gè)SNPs與背膘厚有顯著關(guān)聯(lián)。這些研究說明了廣大研究者正致力于尋找可靠的SNPs用來提高背膘厚的選擇效率，提高經(jīng)濟(jì)效益，然而目前對(duì)于背膘厚的研究多集中于大白、長白等商品豬種，缺乏對(duì)地方優(yōu)質(zhì)品種的研究。

隨著SNPs基因分型陣列、基因表達(dá)分析和其他高通量基因分型技術(shù)的出現(xiàn)，越來越多的與背膘厚度相關(guān)的候選基因被報(bào)道。趨化因子受體1(1)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員，可被穩(wěn)態(tài)或炎癥趨化因子選擇性激活，在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，如：中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞。趨化因子通過與靶細(xì)胞膜上G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的特定趨化因子受體結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)活性。研究表明，CCR1及其配體在機(jī)體呼吸道系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和生長發(fā)育中均發(fā)揮著重要作用。Kogelman等研究發(fā)現(xiàn)，1基因在肥胖豬過度表達(dá)。DKK3是一種多功能蛋白，通過 Wnt/β-catenin 途徑參與各種細(xì)胞過程，如細(xì)胞分化、增殖和凋亡，并導(dǎo)致多種疾病，包括癌癥和慢性心力衰竭等。Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因在脂肪分化和發(fā)育過程中表達(dá)。因此，3基因可能通過這一途徑在脂肪中發(fā)揮不同的作用。本課題組在先前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1和3可作為背膘厚的候選基因。

在養(yǎng)豬業(yè)中，通常測量背膘厚度以指示豬的生產(chǎn)和生長性能。因此，了解控制北京黑豬背膘厚的遺傳決定因素對(duì)于改善肉品質(zhì)、提高育種效率和獲得遺傳進(jìn)展具有重要意義。本試驗(yàn)以413頭北京黑豬為試驗(yàn)對(duì)象，將3和1基因作為影響背膘厚的候選基因，利用PCR直接測序技術(shù)篩選3和1基因上的SNPs，將篩選的SNPs與背膘厚狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出對(duì)北京黑豬背膘厚有重要作用的SNPs位點(diǎn)，以期為北京黑豬肉用生產(chǎn)性能的改良和選育奠定基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本研究使用的北京黑豬均來自北京黑六牧業(yè)科技有限公司，為2020年8月至2020年11月屠宰測定的共413頭北京黑豬，所有的黑豬健康狀況良好、體重相近、飼養(yǎng)管理統(tǒng)一。采集豬的耳組織，置于2 mL 凍存管中，并迅速置于液氮中速凍，后置于-80 ℃ 冰箱冷凍保存。

1.2 性狀測定

用電子游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量右側(cè)胴體六七肋處背膘厚和腰薦處背膘厚，并記錄。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中豬的3基因序列(登錄號(hào)：NM_001039749.1)，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)8對(duì) 引物，覆蓋3基因的全部外顯子區(qū)域。CCl基因序列(登錄號(hào)：NM_001001621.1)，針對(duì)1基因的全部外顯子區(qū)域，共設(shè)計(jì)5對(duì)引物。引物由上海生工生物股份有限公司合成。設(shè)計(jì)引物見表1。

1.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增

取約10 mg背最長肌，置于2 mL研磨管中，后放入冷凍研磨機(jī)中進(jìn)行研磨。使用天根生化有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞/組織/血液DNA提取試劑盒提取總DNA，利用分光光度計(jì)(美國，Thermo Fisher)和1%瓊脂糖檢測合格后，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。

表1 DKK3和CCR1基因擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primers of DKK3 and CCR1 genes

1.5 SNPs多態(tài)性檢驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析

取符合要求的PCR產(chǎn)物送上海生工生物股份有限公司進(jìn)行測序。對(duì)測序結(jié)果用DNAMAN和Chromas軟件進(jìn)行核苷酸序列和波峰圖對(duì)比分析，尋找突變位點(diǎn)。使用Excel計(jì)算等位基因頻率和基因型頻率。運(yùn)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中的Duncan’s多重檢驗(yàn)分析不同位點(diǎn)各基因型對(duì)北京黑豬背膘厚的影響，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用Hapioview4.1軟件對(duì)篩選出的3基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬背膘厚表型統(tǒng)計(jì)

本研究共測定了413頭北京黑豬的背膘厚性狀(表2)。六七肋背膘厚的最大值為5.258 cm，最小值為2.735 cm，平均值為3.067 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.619 cm；腰薦背膘厚的最大值為4.842 cm，最小值為2.437 cm，平均值為2.743 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.695 cm。

表2 北京黑豬背膘厚表型統(tǒng)計(jì)Table 2 Phenotypic statistics of backfat thickness in Beijing black pigs

2.2 DKK3和CCR1基因多態(tài)性分析

3基因外顯子區(qū)域檢測到10個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為g.47385307 G>T、g.47399612 A>G、g.47443779 T>C、g.47443783 C>T、g.47443858 C>T、g.47443903 A>G、g.47444258 C>T、g.47444275 C>T、 g.47444912 G>T和g.47445304 T>C，其中g(shù).47385307 G>T為可變剪切突變，g.47399612 A>G 為錯(cuò)義突變，其余均為3′UTR突變。由表3可知，北京黑豬3基因g.47385307 G>T和g.47444912 G>T突變位點(diǎn)GG基因型為優(yōu)勢基因型(0.674和0.884)，G為優(yōu)勢等位基因，g.47399612 A>G和g.47443903 A>G突變位點(diǎn)AA基因型為優(yōu)勢基因型(0.538和0.786)，A為優(yōu)勢等位基因，g.47443779 T>C突變位點(diǎn)TT基因型為優(yōu)勢基因型(0.509)，T為優(yōu)勢等位基因，g.47445304 T>C突變位點(diǎn)TC基因型為優(yōu)勢基因型(0.382)，C為優(yōu)勢等位基因，其余的突變位點(diǎn)，CC基因型為優(yōu)勢基因型，C均為優(yōu)勢等位基因。

表3 DKK3基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 3 The genotype and allele frequencies of polymorphism sites of DKK3 gene

1基因外顯子區(qū)域檢測到3個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為g.29229037 G>A、g.29229315 T>C和g.29229694 C>T， 其中c g.29229037 G>A和g.29229694 C>T 為同義突變，g.29229315 T>C為錯(cuò)義突變。由表4可知，北京黑豬1基因g.29229037 G>A 突變位點(diǎn)GA基因型為優(yōu)勢基因型(0.363)，G為優(yōu)勢等位基因，g.29229315 T>C突變位點(diǎn)TC基因型為優(yōu)勢基因型(0.393)，T為優(yōu)勢等位基因，g.29229694 C>T突變位點(diǎn)CC基因型為優(yōu)勢基因型(0.506)，C為優(yōu)勢等位基因。

表4 CCR1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率Table 4 The genotype and allele frequencies of polymorphism sites of CCR1 gene

2.3 基因多態(tài)性與背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用SAS軟件對(duì)北京黑豬1和3基因突變位點(diǎn)與六七肋背膘厚和腰薦部背膘厚進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，由表5可知，有4個(gè)3′UTR突變位點(diǎn)均與腰薦部背膘厚顯著關(guān)聯(lián)(<0.05)，分別為g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、g.47444912 G>T和g.47445304 T>C，其余位點(diǎn)與六七肋背膘厚和腰薦部背膘厚均不顯著關(guān)聯(lián)(>0.05)，其中g(shù).47443779 T>C位點(diǎn)TT基因型個(gè)體的腰薦背膘厚顯著高于CC基因型個(gè)體(<0.05)，g.47444258 C>T位點(diǎn)CC和CT基因型個(gè)體的腰薦背膘厚顯著高于TT基因型個(gè)體(<0.05)，g.47444912 G>T位點(diǎn)的TT基因型個(gè)體腰薦背膘厚顯著高于GT基因型個(gè)體(<0.05)，g.47445304 T>C位點(diǎn)CC基因型個(gè)體的腰薦背膘厚顯著高于TT基因型個(gè)體(<0.05)。由表6可知，1基因只有1個(gè)突變位點(diǎn)基因型與六七肋背膘厚顯著相關(guān)(<0.05)， g.29229037 G>A位點(diǎn)GG基因型個(gè)體的六七肋背膘厚顯著高于AA基因型個(gè)體(<0.05)。

表5 北京黑豬DKK3基因10個(gè)SNPs與背膘厚的關(guān)聯(lián)分析Table 5 Association analysis of 10 SNPs in DKK3 gene and backfat thickness in Beijing black pigs

表6 北京黑豬CCR1基因3個(gè)SNPs與背膘厚的關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of 3 SNPs in CCR1 gene and backfat thickness in Beijing black pigs

2.4 連鎖不平衡分析

對(duì)3的10個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析，分析結(jié)果顯示(圖1)，共形成了2處連鎖不平衡模塊，分別是g.47443779 T>C、g.47443783 C>T和g.47443858 C>T形成了第一個(gè)模塊，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T形成了第二個(gè)模塊。其中g(shù).47443779 T>C和g.47443783 C>T處于完全連鎖狀態(tài)(D’=1), g.47443783 C>T和g.47443858 C>T處于完全連鎖狀態(tài)(D’=1)，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T呈現(xiàn)高度連鎖狀態(tài)(D’=0.98)。由表7和表8可知，block1形成4種單倍型，block2形成3種單倍型。

表7 DKK3基因block1單倍型及其頻率Table 7 The haplotypes and their frequencies of DKK3 gene block1

表8 DKK3基因block2單倍型及其頻率Table 8 The haplotypes and their frequencies of DKK3 gene block2

圖1 北京黑豬DKK3基因SNPs的連鎖不平衡Fig.1 The linkage disequilibrium analysis of SNPs in DKK3 gene in Beijing black pigs

3 討 論

作為家豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀，背膘厚在豬遺傳學(xué)中得到了廣泛的研究。高背膘厚不僅導(dǎo)致飼料效率低下，而且也不受消費(fèi)者的青睞。在滿足消費(fèi)者需求的同時(shí)，生豬養(yǎng)殖的目標(biāo)是在不影響豬肉口感的前提下，降低胴體脂肪，提高瘦肉率。目前的研究多集中于杜洛克、大白豬和約克夏豬等商品豬背膘厚。北京黑豬作為中國培育的優(yōu)良品種之一，毛黑色，中等體型和生長速度快，肉色鮮紅，大理石紋評(píng)分高，被認(rèn)為是高端豬肉之一。然而對(duì)影響北京黑豬背膘厚相關(guān)SNPs的研究卻鮮見報(bào)道。本研究以3和1基因?yàn)橛绊懕本┖谪i背膘厚的候選基因，探究其基因多態(tài)性對(duì)北京黑豬背膘厚性狀的影響，以期能夠篩選出可用于提高北京黑豬背膘厚性狀的分子標(biāo)記。

背膘厚度是家豬脂肪沉積的典型數(shù)量性狀，顯示出中等至高度的遺傳性。本研究利用SAS軟件對(duì)檢測到的突變位點(diǎn)的不同基因型分別與北京黑豬的背膘厚進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，希望為北京黑豬背膘厚研究提供更多的SNPs標(biāo)記。在1外顯子檢測到3個(gè)SNPs，其中2個(gè)為同義突變(g.29229037 G>A和g.29229694 C>T)，1個(gè)為錯(cuò)義突變(g.29229315 T>C)。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，g.29229037 G>A GG基因型個(gè)體的六七肋背膘厚顯著高于AA基因型個(gè)體(<0.05)。 目前對(duì)于1突變位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)其多與疾病有關(guān)。Toyoda等發(fā)現(xiàn),1基因rs3181077位點(diǎn)與發(fā)作性睡病有關(guān)。此外，位于人類1基因3′-側(cè)翼區(qū)域的SNPs與Beh?et綜合征密切相關(guān)，Beh?et綜合征被認(rèn)為是一種以眼/皮膚炎癥、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍和生殖器潰瘍?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?。已有?bào)道1基因是人體脂肪組織中甘油三酯調(diào)控的關(guān)鍵候選基因。本研究在北京黑豬群體中發(fā)現(xiàn)1基因g.29229037 G>A突變與六七肋背膘厚顯著相關(guān)。

在北京黑豬3基因的外顯子區(qū)共檢測到10個(gè)SNPs，其中有4個(gè)突變位點(diǎn)(g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、 g.47444912 G>T和g.47445304 T>C)基因型與腰薦背膘厚顯著相關(guān)(<0.05)。3與Wnt/B-catenin信號(hào)通路相關(guān)，Wnt/B-catenin 信號(hào)通路相關(guān)基因在脂肪分化發(fā)育過程中表達(dá)。該信號(hào)通路可阻斷脂肪分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(C/EBPα和PPARγ)的表達(dá)，從而影響脂肪分化。因此，3基因可能通過這一途徑在脂肪中發(fā)揮不同的作用。這4個(gè)位點(diǎn)突變均為3′UTR 突變，說明3′UTR突變對(duì)于豬背膘厚性狀具有重要影響。Zang等在豬2基因中發(fā)現(xiàn)其3′UTR 的多態(tài)位點(diǎn)與豬背膘厚和瘦肉率顯著相關(guān)。研究表明，3′UTR包含miRNA的靶點(diǎn)。miRNA是短的內(nèi)源性RNA，通過與3′UTR中的位點(diǎn)配對(duì)來調(diào)節(jié)靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而發(fā)揮重要的基因調(diào)控作用。miRNA已被證明在廣泛的生物過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，例如發(fā)病機(jī)制、組織發(fā)育、脂肪細(xì)胞分化和脂肪生成等過程。第一個(gè)報(bào)道的miRNA對(duì)脂質(zhì)代謝的影響是在果蠅中，其中miR-14的缺失導(dǎo)致甘油三酯和甘油二酯的積累增加。所以miRNA可能通過調(diào)控3基因3′UTR 進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝，本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-3477-5p 可以通過調(diào)節(jié)靶基因3進(jìn)而影響脂肪生成。下一步可以進(jìn)行3基因4個(gè)3′UTR突變的靶向miRNA研究。

相對(duì)于單個(gè)SNPs對(duì)表型的影響，一組具有連鎖效應(yīng)的SNPs所形成單倍型的作用更大。因此本研究對(duì)3的10個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析，分析結(jié)果顯示g.47443779 T>C-g.47443783 C>T處于完全連鎖狀態(tài)(D’=1)，g.47443783 C>T-g.47443858 C>T處于完全連鎖狀態(tài)(D’=1)，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T呈現(xiàn)高度連鎖狀態(tài)(D’=0.98)。所以雖然g.47443783 C>T與g.47444275 C>T位點(diǎn)不同基因型與背膘厚關(guān)聯(lián)時(shí)無顯著差異，但是可以認(rèn)為其是影響背膘厚的潛在SNPs。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)檢測北京黑豬群體中1和3基因的SNPs位點(diǎn)，并分析了這些SNPs位點(diǎn)與背膘厚性狀的相關(guān)性。北京黑豬3基因的g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、g.47444912 G>T和g.47445304 T>C位點(diǎn)與北京黑豬的腰薦背膘厚顯著相關(guān)；1基因的g.29229037 G>A位點(diǎn)與北京黑豬的六七肋背膘厚顯著相關(guān)。本研究為1和3基因作為北京黑豬背膘厚性狀的候選基因應(yīng)用于豬遺傳育種提供了參考。