中藥多糖作為免疫增強(qiáng)劑及其對(duì)腸道黏膜影響的研究進(jìn)展

伯若楠，王 晶，劉曉盼，劉明江，李金貴*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2. 江蘇省高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚(yáng)州 225009)

隨著我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖程度的不斷提高，動(dòng)物疫病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越大。大多數(shù)病原微生物主要是通過(guò)黏膜途徑入侵動(dòng)物機(jī)體的，如大腸桿菌、沙門(mén)菌、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒等。腸道是動(dòng)物體腔與外界環(huán)境的最大接觸面，易被腸道病原體定植和入侵，而腸道黏膜就構(gòu)成了保護(hù)動(dòng)物機(jī)體免受外來(lái)病原微生物侵?jǐn)_的第一道重要防線。通過(guò)黏膜途徑接種疫苗能更容易、更有效地誘導(dǎo)保護(hù)性黏膜免疫反應(yīng)，切斷病原體的感染途徑。研究與實(shí)踐證明消化道黏膜免疫不僅在局部和其他黏膜組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可激發(fā)全身性體液免疫應(yīng)答。然而，傳統(tǒng)的活疫苗和弱毒活疫苗，雖然可以增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，但安全性較差。亞單位抗原、重組蛋白的新型疫苗和滅活疫苗雖然更加安全，但免疫原性較差，且目前使用的大多數(shù)疫苗都是肌肉或皮下注射接種，無(wú)法直接作用于黏膜來(lái)激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)。一種成功的黏膜疫苗需要同時(shí)激活先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)最佳的保護(hù)作用和持續(xù)時(shí)間，但目前所應(yīng)用的抗原通常會(huì)受到腸消化液的降解，誘導(dǎo)的反應(yīng)相對(duì)較弱。因此，為誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答，適當(dāng)?shù)拿庖咴鰪?qiáng)劑是必要的。

針對(duì)腸道復(fù)雜的環(huán)境，人們一直努力探索潛在的新型黏膜免疫增強(qiáng)劑。多糖是生物體中廣泛存在的物質(zhì)?，F(xiàn)今植物多糖研究日益受到關(guān)注，國(guó)際科學(xué)界甚至提出21世紀(jì)是多糖的世紀(jì)。許多研究表明，中藥多糖安全低毒，具有抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，是一種優(yōu)良的免疫增強(qiáng)劑。中藥多糖通過(guò)激活樹(shù)突狀細(xì)胞并促進(jìn)其成熟、激活巨噬細(xì)胞功能、促進(jìn)T/B淋巴細(xì)胞的增殖和活化、抑制Tregs的功能，增加轉(zhuǎn)錄因子NOD樣受體蛋白3(NLRP3)的表達(dá)等多種作用機(jī)制發(fā)揮免疫增強(qiáng)效應(yīng)。但中藥多糖通常作為系統(tǒng)免疫增強(qiáng)劑使用，應(yīng)用于黏膜免疫的相對(duì)較少，且它們的黏膜免疫效力尚未得到系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。因此，本文對(duì)近年來(lái)應(yīng)用于黏膜免疫的不同類型的中藥多糖免疫增強(qiáng)劑，以及中藥多糖對(duì)腸道黏膜的影響進(jìn)行了綜述，以期為開(kāi)發(fā)安全有效的新型黏膜免疫增強(qiáng)劑提供更多新思路。

1 不同類型的中藥多糖黏膜免疫增強(qiáng)劑

研究表明，多種中藥多糖具有增強(qiáng)黏膜免疫的作用，如地黃多糖、黃芪多糖、香菇多糖、黑靈芝多糖、淫羊藿多糖等，可以作為黏膜免疫增強(qiáng)劑的候選藥物。然而，受自身結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)的影響，中藥多糖存在臨床用量大、靶向性差的問(wèn)題。為了進(jìn)一步提高中藥多糖的生物活性或者改變藥物劑型，研究者們對(duì)中藥多糖進(jìn)行了不同類型的修飾與利用，如化學(xué)修飾、物理裝載和微生物發(fā)酵等，制備出比天然中藥多糖效果更佳的免疫增強(qiáng)劑，以期提高中藥多糖的生物利用度和靶向性。

1.1 化學(xué)方法修飾中藥多糖

對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾是開(kāi)發(fā)多糖類藥物的重要途徑之一。對(duì)于多糖的化學(xué)修飾，最常見(jiàn)的方法是硒化、硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙?；?。通過(guò)化學(xué)方式來(lái)改變或重建多糖結(jié)構(gòu)，可得到具有更全面生物活性的多糖衍生物，從而產(chǎn)生不一樣的生理活性，進(jìn)一步拓寬其臨床應(yīng)用范圍。其中硒化多糖較為常見(jiàn)，硒多糖是多糖和硒相結(jié)合的產(chǎn)物，不僅兼有硒和多糖各自的生物活性，還具有硒多糖所特有的生物活性。之前的研究證明，硒化修飾大蒜多糖(sGPS)是一種安全有效的潛在黏膜免疫增強(qiáng)劑，與疫苗免疫對(duì)照組相比，sGPS可顯著提高雞新城疫血凝抑制(HI)的抗體滴度，促進(jìn)空腸和氣管沖洗液分泌型IgA(sIgA)、IFN-γ、IL-2的分泌。金清將黃芪多糖協(xié)同硫酸化淫羊藿多糖灌喂仔豬后發(fā)現(xiàn)，明顯改善了仔豬小腸腸道的形態(tài)，提高了仔豬十二指腸、空腸、回腸sIgA的含量，激活了腸道TLR/NF-κB介導(dǎo)的IRF-3依賴信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)宿主免疫功能。兩種多糖的協(xié)同作用顯著改善仔豬腸道的組織結(jié)構(gòu)發(fā)育和物理屏障功能。研究表明多糖衍生物可作為黏膜免疫增強(qiáng)劑被更為廣泛的應(yīng)用。

1.2 利用遞送載體裝載中藥多糖

將中藥多糖直接用于黏膜免疫增強(qiáng)劑不能突破黏膜系統(tǒng)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的限制以及免受酸性環(huán)境的破壞，而藥物遞送載體可有效改善這一情況。脂質(zhì)體、PLGA、殼聚糖等藥物遞送載體裝載多糖后，不僅可以抵抗外界物質(zhì)的破壞，還能對(duì)載體表面進(jìn)行適當(dāng)修飾，增加其靶向性。因此，中藥多糖通過(guò)藥物遞送載體的裝載，可以提高多糖口服的生物利用度，誘導(dǎo)機(jī)體獲得更佳的免疫應(yīng)答效應(yīng)。

脂質(zhì)體可以被抗原遞呈細(xì)胞(APC)內(nèi)吞，可有效地作為黏膜疫苗傳遞系統(tǒng)發(fā)揮作用。Kaneko等發(fā)現(xiàn)將藥物包入脂質(zhì)體后口服給藥，藥物可靶向并被攝入到派伊爾小結(jié)(Peyer結(jié))中，誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。周兆海等研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)多糖脂質(zhì)體能夠促進(jìn)雛雞接種禽流感疫苗的免疫效果，增強(qiáng)機(jī)體腸黏膜免疫功能，作用效果優(yōu)于玉屏風(fēng)多糖。玉屏風(fēng)多糖脂質(zhì)體顯著增加小腸絨毛長(zhǎng)度、小腸上皮內(nèi)和固有層淋巴細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞的成熟和增殖，高劑量玉屏風(fēng)多糖脂質(zhì)體比天然玉屏風(fēng)多糖的效果更佳。另外，殼聚糖納米粒子具有低毒性、良好的生物降解性和黏附性等特性，作為口服疫苗載體可以保持緩慢和持續(xù)的抗原釋放，有效防止抗原在到達(dá)黏膜組織誘導(dǎo)部位之前被降解，激活全身黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。此外，PLGA、微膠囊等藥物遞送載體也具有一定的開(kāi)發(fā)潛力被用于中藥多糖裝載。

1.3 其他類型的中藥多糖黏膜免疫增強(qiáng)劑

1.3.1 微生物發(fā)酵中藥多糖 發(fā)酵是中藥炮制的重要方法之一，是利用微生物發(fā)酵中草藥來(lái)提高其有效成分的提取率和藥效。這樣能最大限度地保護(hù)中藥活性物質(zhì)免遭破壞，還能將許多大分子活性物質(zhì)降解為可直接吸收利用的小分子活性物質(zhì)。另外，微生物可分解中藥內(nèi)有毒成分，降低中藥的毒副作用。梁子敬使用雞盲腸內(nèi)容物分離得到的非解乳糖鏈球菌FGM發(fā)酵處理黃芪(FAPS)，發(fā)現(xiàn)多糖的提取率顯著提高，且多糖結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。連續(xù)灌胃后，F(xiàn)APS有效緩解了環(huán)磷酰胺(CY)造成的腸道黏膜損傷以及腸道上皮細(xì)胞黏附連接損傷。因此，發(fā)酵多糖可以被開(kāi)發(fā)作為黏膜免疫增強(qiáng)劑。

1.3.2 離子輻射修飾中藥多糖 離子輻射是通過(guò)射線斷裂天然多糖中糖苷鍵的一種物理修飾方法。與其他改性方法(如酸水解和酶處理)相比，使用離子輻射擁有更高的重復(fù)性和產(chǎn)率，對(duì)環(huán)境友好。與黃芪多糖(APS)相比，γ-輻射黃芪多糖(IAPS)分子量和黏度降低，溶解度增加，更容易通過(guò)腸道M細(xì)胞穿透屏障，刺激黏膜免疫反應(yīng)?？诜蘒APS后，免疫抑制雞的空腸杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)和十二指腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、IgA漿細(xì)胞計(jì)數(shù)比黃芪多糖組相關(guān)指標(biāo)更高。因而，離子輻射修飾中藥多糖可以作為一種潛在的替代方法被用于開(kāi)發(fā)新型黏膜免疫增強(qiáng)劑。

2 中藥多糖作為免疫增強(qiáng)劑對(duì)腸道黏膜的影響

不同類型的中藥多糖被開(kāi)發(fā)作為免疫增強(qiáng)劑，有研究表明中藥多糖具有修復(fù)腸道黏膜損傷和促進(jìn)腸道黏膜免疫的作用。而且它們?cè)谀c道黏膜中發(fā)揮作用的方式是多樣的，主要通過(guò)以下幾種方式：影響腸道黏膜機(jī)械屏障和免疫細(xì)胞、影響腸道sIgA和細(xì)胞因子的分泌、影響腸道共生菌群等。

2.1 對(duì)腸道黏膜機(jī)械屏障的影響

腸道機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接蛋白組成，是保護(hù)腸道免受外部環(huán)境中病原體或有害物質(zhì)侵入腸黏膜的關(guān)鍵，也是維持腸上皮選擇性通透性及其屏障功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接蛋白是由跨膜蛋白o(hù)ccludin、claudin-1及胞內(nèi)蛋白ZO-1組成，而腸道上皮細(xì)胞(IEC)主要有柱狀上皮細(xì)胞、M細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和未分化細(xì)胞等，其細(xì)胞具有快速增殖和再生能力，以維持腸黏膜機(jī)械屏障功能。M細(xì)胞在黏膜免疫應(yīng)答中起重要的作用，缺乏M細(xì)胞的小鼠，其漿細(xì)胞發(fā)育遲緩。靶向M細(xì)胞的抗原遞送是增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的上佳策略?？诜愎蕉嗵呛螅庖咭种菩∈蟮腜eyer結(jié)中的M細(xì)胞數(shù)量部分恢復(fù)，并且由于進(jìn)入胃腸道的中藥多糖具有高親水性和大尺寸的特點(diǎn)，無(wú)法被機(jī)體直接消化吸收，也難以被腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，但它可以被腸內(nèi)Peyer結(jié)吸收，靶向于M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響腸黏膜免疫系統(tǒng)。此外，Xie等的研究結(jié)果表明，霍山石斛多糖可上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸道物理屏障功能。靈芝菌絲多糖通過(guò)上調(diào)occludin的表達(dá)、降低腸道通透性來(lái)改善大鼠腸道機(jī)械屏障功能。杯狀細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致黏液層缺陷，最終使細(xì)菌與表面上皮的黏附增加，增加病原微生物入侵的風(fēng)險(xiǎn)。黑靈芝多糖通過(guò)增加杯狀細(xì)胞數(shù)量和上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)量，可恢復(fù)小鼠因CY導(dǎo)致受損的黏膜屏障。

2.2 對(duì)腸道sIgA、細(xì)胞因子分泌的影響

中藥多糖除了有助于保護(hù)腸道機(jī)械屏障的完整性之外，對(duì)腸道黏膜抗體和細(xì)胞因子分泌也有促進(jìn)作用。sIgA是黏膜免疫的主效因子，占黏膜相關(guān)組織產(chǎn)生的所有抗體的80%以上，是黏膜免疫反應(yīng)的標(biāo)志。sIgA能與相應(yīng)病原微生物結(jié)合，阻止病原體黏附到細(xì)胞表面，而使其喪失感染能力，在保護(hù)黏膜屏障方面發(fā)揮著重要作用。此外，sIgA主要是由黏膜固有層IgA漿細(xì)胞合成分泌，IgA漿細(xì)胞的形成是產(chǎn)生大量sIgA的關(guān)鍵。而固有層漿細(xì)胞分泌的二聚體IgA需與上皮膜上的多聚免疫球蛋白受體(pIgR)結(jié)合才可刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，每個(gè)sIgA的轉(zhuǎn)運(yùn)都需消耗一個(gè)pIgR分子，pIgR的大量產(chǎn)生也是sIgA跨細(xì)胞發(fā)揮作用的關(guān)鍵?？诜S芪多糖能增加空腸中IgA細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致分泌更多的sIgA，有利于增強(qiáng)腸黏膜免疫功能。此外，黃芪多糖也顯著升高了雞空腸中NDV特異性sIgA水平，顯著增強(qiáng)了雞黏膜對(duì)NDV疫苗的免疫應(yīng)答。龍眼肉多糖通過(guò)改善IgA漿細(xì)胞的生成和遷移、增加pIgR的表達(dá)，從而加強(qiáng)sIgA的腸道分泌。

受抗原刺激后，腸道黏膜免疫細(xì)胞可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。細(xì)胞因子間相互促進(jìn)或拮抗，共同參與腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)。目前研究較多的是炎性細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和抗炎性因子(IL-4、IL-5、IL-10)等。IL-4是一種Th2細(xì)胞因子，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞的增殖和分化，并在sIgA的形成中起重要作用。丘富安等研究表明，參芪多糖口服液可增加CY免疫抑制雞空腸黏膜中IL-4的濃度。此外，IFN-γ、TNF-α、IL-1及IL-4存在協(xié)同作用上調(diào)pIgR的表達(dá)，IL-17也被證明可增強(qiáng)黏膜上皮細(xì)胞中pIgR的表達(dá)，而pIgR的高效表達(dá)可促進(jìn)sIgA的分泌。

2.3 對(duì)腸道黏膜免疫細(xì)胞的影響

研究表明，腸黏膜分布著大量的免疫細(xì)胞群，如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，在協(xié)調(diào)特異性黏膜免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。為維持腸道黏膜完整性，腸道黏膜免疫細(xì)胞須對(duì)外源性和內(nèi)源性潛在病原體作出適當(dāng)且有效的免疫反應(yīng)。腸黏膜中大量的淋巴細(xì)胞主要集中于三個(gè)重要區(qū)域，上皮層、黏膜固有層和黏膜淋巴樣濾泡。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量是評(píng)估小腸局部黏膜免疫屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的良好指標(biāo)，太子參莖葉多糖在一定程度提高了腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量。松花粉多糖有效緩解環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的腸道Peyer結(jié)中CDT以及CDCDT比例的升高，同時(shí)可以使CD/CDT細(xì)胞比例恢復(fù)到正常水平。研究表明松花粉多糖還通過(guò)TLR/MAPK/NF-κB信號(hào)通路激活雞巨噬細(xì)胞HD11細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

此外，樹(shù)突狀細(xì)胞活化后，可促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)活化T細(xì)胞的遷移和B細(xì)胞的免疫反應(yīng)。鹿秀云等證明，黃芪多糖通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)水平，影響腸道健康。另外，黃芪多糖還可通過(guò)誘導(dǎo)Peyer結(jié)中Tregs分化成熟和抑制IL-17分泌來(lái)對(duì)結(jié)腸炎起到保護(hù)作用。經(jīng)黃芪多糖治療后，增加了結(jié)腸組織中CD4CD25T細(xì)胞和CD4CD25Foxp3T細(xì)胞的數(shù)量，并降低了IL-17的水平。

2.4 對(duì)腸道共生菌群的影響

腸道內(nèi)存在著大量共生菌群，腸道菌群具有影響腸黏膜免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育與成熟和調(diào)控腸黏膜屏障與免疫功能的雙重作用。Chen等發(fā)現(xiàn)，黃連多糖可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性、組成和分布。Ying等也證明，冬蟲(chóng)夏草多糖改善了微生物群落多樣性，增加了益生菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌)的豐度，減少了病原菌(梭狀芽胞桿菌、彎曲螺旋體)。術(shù)苦芩總多糖可抑制常見(jiàn)腸道致病菌生長(zhǎng)，改變腹瀉仔豬腸道微生物群的豐富度和多樣性，提高乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，并改善菌群結(jié)構(gòu)(芽胞桿菌綱、乳酸桿菌屬相對(duì)豐度顯著上升，梭菌綱相對(duì)豐度極顯著下降)。此外，部分中藥多糖還可通過(guò)抗氧化作用對(duì)腸道微環(huán)境產(chǎn)生影響。川芎多糖顯著促進(jìn)主要抗氧化酶(超氧化物歧化酶1、超氧化物歧化酶2、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶1、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1)的表達(dá)，空腸和盲腸的抗氧化能力也顯著增加，可有效對(duì)腸道的氧化應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用。上述研究表明，部分中藥多糖可直接或間接誘導(dǎo)腸道菌群的變化，影響宿主腸道菌群的豐度、種類和比例。

3 小結(jié)與展望

目前，現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)向集約化、規(guī)?；较虬l(fā)展，以往的免疫接種方式如肌肉注射、皮下注射，不僅耗時(shí)費(fèi)力、造成動(dòng)物應(yīng)激，且無(wú)法激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答，不能滿足未來(lái)大規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展趨勢(shì)。因此，氣霧、滴鼻、點(diǎn)眼、飲水等簡(jiǎn)單易行的黏膜免疫途徑越來(lái)越受到關(guān)注，而開(kāi)發(fā)安全有效的黏膜免疫增強(qiáng)劑就成為黏膜免疫的研究重點(diǎn)之一。中藥多糖因其天然、低毒、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。由化學(xué)修飾、物理裝載和微生物發(fā)酵等方式獲得的不同類型的中藥多糖也各具優(yōu)勢(shì)。有研究表明中藥多糖具有修復(fù)腸道黏膜損傷和促進(jìn)腸道黏膜免疫的作用。然而，中藥多糖的提取方式繁瑣，中藥材品種、來(lái)源、年份不同，導(dǎo)致提取率較低、不穩(wěn)定，提取過(guò)程也對(duì)原材料造成大量浪費(fèi)，無(wú)法大規(guī)模推廣應(yīng)用于臨床。此外，關(guān)于中藥多糖作為免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用主要集中于全身系統(tǒng)免疫，對(duì)局部黏膜免疫影響的研究甚少，對(duì)腸道黏膜免疫機(jī)理的研究更少，這限制了中藥多糖在黏膜免疫增強(qiáng)劑方面的應(yīng)用。隨著對(duì)中藥多糖相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)技術(shù)的日趨完善和提高，相信中藥多糖的開(kāi)發(fā)和利用在畜牧業(yè)將具有更加廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。