大蒜中黃酮類化合物的提取及抗疲勞活性研究

黨劍,趙民

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

大蒜屬于百合科蔥屬植物的地下鱗莖，是一種常用的調(diào)味品。我國從漢代開始引進大蒜種植，之后擴散到全國各地。目前，我國是大蒜的主要生產(chǎn)國，大蒜年產(chǎn)量約為400萬噸。

大蒜中富含微量元素，包括鎂、釩、鐵、鈣、鋁、銅等，其中，大蒜中含量最高的元素是磷，其次是鐵、鎂、鋅和鋁，此外，大蒜中也含有豐富的化學(xué)成分，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素B和維生素C，具有多種生物功效。自古以來，大蒜的藥用價值都被人們熟知和利用，《本草綱目》中記載了大蒜的通竅、驅(qū)寒、助消化等多種生物功效，近代科學(xué)研究結(jié)果也表明，大蒜具有抗菌、防治心血管疾病、抑制腫瘤、改善肝臟機能等多種生物功效。

黃酮是從天然植物中分離提純所獲得的化合物，是一種植物的次級代謝產(chǎn)物，主要存在于植物的花、根、莖、葉中。黃酮類化合物在治療人類疾病方面表現(xiàn)突出，已經(jīng)被用于治療人類心血管疾病、抗氧化、抗菌、抗炎和降血脂。隨著抗癌藥物的研究，人們對戰(zhàn)勝癌癥的信心也越來越足，現(xiàn)代科學(xué)家們正向天然抗癌藥物的方向前進，黃酮類化合物能夠抑制癌細胞擴散和生長，有望成為人類抗癌藥物的突破口。黃酮類化合物也具有殺菌作用，通過破壞微生物細胞膜的完整性，黃酮類化合物可以影響微生物內(nèi)的電子傳遞和營養(yǎng)吸收，從根本上抑制微生物的生長。

黃酮類化合物一般難溶于水，易溶于乙醇，這與黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)存在著密切的關(guān)系。常用的黃酮提純方法有熱水浸提法、有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法。黃酮類化合物提純在多種植物中已有研究報道，但是大蒜中黃酮的提純研究報道相對較少。本研究基于此，通過有機溶劑提取法、單因素試驗法和正交試驗法對大蒜中黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，并對大蒜的抗疲勞活性進行比較。

1 試驗材料與設(shè)備

新鮮白皮大蒜：購于當(dāng)?shù)爻校テず?，?0 ℃的恒溫箱中烘干，粉碎，過80目篩，冷藏保存。

蘆丁標(biāo)準品；無水乙醇。

設(shè)備：烘箱；粉碎機；藥物天平；分析天平；恒溫水浴鍋；超聲清洗器；離心機；紫外分光光度計。

2 試驗方法

2.1 大蒜黃酮提取量測定

稱取一定量的樣品置于離心管中，使用離心機在3000 r/min的轉(zhuǎn)速下進行離心，測定其吸光值A(chǔ)，通過紫外分光光度計測定大蒜中黃酮的提取量，根據(jù)標(biāo)準曲線的方程計算出黃酮的質(zhì)量濃度C，按照下式計算黃酮的提取量：

Y(大蒜黃酮提取量，mg/g)=[黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)×總體積(mL)×稀釋倍數(shù)]/大蒜粉末質(zhì)量(g)。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對大蒜黃酮提取量的影響

稱取大蒜樣品0.20 g，在水浴溫度50 ℃、水浴時間3.5 h和乙醇濃度60%的條件下，研究液料比(60∶1、65∶1、70∶1、75∶1、80∶1)對大蒜中黃酮提取量的影響。

2.2.2 水浴時間對大蒜黃酮提取量的影響

稱取大蒜樣品0.20 g，在水浴溫度50 ℃、液料比70∶1和乙醇濃度60%的條件下，研究水浴時間(2，2.5，3，3.5，4，4.5，5 h)對大蒜中黃酮提取量的影響。

2.2.3 水浴溫度對大蒜黃酮提取量的影響

稱取大蒜樣品0.20 g，在液料比70∶1、水浴時間3.5 h和乙醇濃度60%的條件下，研究水浴溫度(30，40，50，60，70 ℃)對大蒜中黃酮提取量的影響。

2.2.4 乙醇濃度對大蒜黃酮提取量的影響

稱取大蒜樣品0.20 g，在水浴溫度50 ℃、水浴時間3.5 h和液料比70∶1的條件下，研究乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對大蒜中黃酮提取量的影響。

2.3 正交試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理，以液料比、乙醇濃度、水浴時間和水浴溫度為變量因子，以大蒜中黃酮提取量作為指標(biāo)，進行四因素三水平分析(見表1)，對大蒜中黃酮的提取條件進行優(yōu)化。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 大蒜中黃酮類化合物提取工藝

3.1.1 液料比對大蒜中黃酮提取量的影響

由圖1可知，大蒜中黃酮提取量直接受到液料比的影響，液料比過大或者過小都會影響大蒜中黃酮的提取量。當(dāng)液料比為70∶1時，大蒜中黃酮的提取量最大，為0.81 mg/g。當(dāng)液料比小于70∶1時，大蒜中黃酮的提取量隨著液料比的增大而增加，這是由于液料比增加，大蒜與乙醇的接觸面積增大，黃酮的提取量也隨之增加。當(dāng)液料比大于70∶1時，大蒜中黃酮提取量隨之減小，這是由于提取液體積增大，大蒜的濃度降低，大蒜中的其他物質(zhì)進入了料液中，從而導(dǎo)致黃酮的提取量減小。所以，最適的液料比為70∶1。

圖1 液料比對大蒜中黃酮提取量的影響

3.1.2 水浴時間對大蒜中黃酮提取量的影響

由圖2可知，當(dāng)水浴時間小于3.5 h時，大蒜中黃酮的提取量隨著時間的增長而增加，當(dāng)水浴時間達到3.5 h時，大蒜中黃酮的提取量為0.8 mg/g。當(dāng)水浴時間大于3.5 h時，大蒜中黃酮的提取量隨著提取時間的增長而逐漸減小，這是由于當(dāng)水浴時間過短時，大蒜中的黃酮成分不能充分溶解于溶液中，隨著提取時間的延長，大蒜中除了黃酮以外的其他成分進入溶液中，造成大蒜中的黃酮溶解量減小，此外，黃酮成分不穩(wěn)定，受溫度影響較為明顯，長時間水浴導(dǎo)致黃酮成分分解。所以，最適的大蒜水浴時間為3.5 h。

圖2 水浴時間對大蒜中黃酮提取量的影響Fig.2 The effect of water bath time on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.3 水浴溫度對大蒜中黃酮提取量的影響

由圖3可知，大蒜中黃酮的提取量隨著水浴溫度的升高先增大后減小，當(dāng)溫度低于50 ℃時，大蒜中黃酮的提取量隨著溫度的升高而增加；當(dāng)溫度超過50 ℃時，大蒜中黃酮的提取量隨著溫度的升高而減少。這是由于隨著溫度的升高，溶液中的分子運動速率加快，使得大蒜中黃酮的提取量增加，但當(dāng)溫度升高到一定程度時，大蒜中的其他物質(zhì)也會溶解到溶液中，并且過高的溫度會導(dǎo)致黃酮類化合物氧化，從而降低大蒜中黃酮的得率。所以，最適的水浴溫度為50 ℃。

圖3 水浴溫度對大蒜中黃酮提取量的影響Fig.3 The effect of water bath temperature on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.4 乙醇濃度對大蒜中黃酮提取量的影響

由圖4可知，大蒜中黃酮的提取量隨著乙醇濃度的增加先增加后減少，當(dāng)乙醇濃度達到60%時，大蒜中黃酮的提取量最大，為0.87 mg/g。當(dāng)乙醇濃度低于60%時，大蒜中黃酮的提取量隨著乙醇濃度的增加而增加。當(dāng)乙醇濃度高于60%時，大蒜中黃酮的提取量隨著乙醇濃度的增加而減少。乙醇含有極性，當(dāng)乙醇濃度達到60%時，溶液中的極性與黃酮中的極性非常相似。所以，選擇60%的乙醇濃度作為黃酮提取的最佳條件。

圖4 乙醇濃度對大蒜中黃酮提取量的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on the extraction amount of flavonoids from garlic

3.1.5 大蒜黃酮提取工藝正交試驗

為了研究大蒜黃酮化合物提取的最佳工藝，通過正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，在單因素基礎(chǔ)條件下，研究液料比、乙醇濃度、水浴時間和水浴溫度對大蒜中黃酮提取量的影響，以單因素試驗結(jié)果作為試驗數(shù)據(jù)范圍，以A液料比、B乙醇濃度、C水浴時間和D水浴溫度作為考察因素，以黃酮提取量作為酒精指標(biāo)，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 大蒜黃酮提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test for extracting flavonoids from garlic

由表2可知，影響大蒜中黃酮類化合物提取的因素是水浴時間>液料比>乙醇濃度>水浴溫度，優(yōu)化后的最優(yōu)大蒜黃酮提取組合為ABCD，即液料比65∶1，乙醇濃度50%，水浴時間3.5 h和水浴溫度50 ℃。在此條件下大蒜黃酮類化合物提取量最高，為0.87 mg/g。

3.2 大蒜黃酮類化合物抗疲勞活性研究

人體的疲勞程度可以通過多個方面表現(xiàn)出來。本試驗通過對比運動員服用大蒜多糖之前和之后跑400 m花費的時間、運動后的血糖、心跳和血壓，并計算平均值，對大蒜中黃酮的抗疲勞活性進行研究?；镜脑囼灢僮鞣椒椋哼x取5個男運動員，進行為期1個月的試驗，在試驗開始之前跑400 m，測量出每個人的血糖、心跳和血壓；每天服用1次大蒜多糖，30 d后，再次跑400 m，記錄花費的時間、運動后的血糖、心跳和血壓，計算平均值。比較同一組運動員服用大蒜多糖之前和之后的運動時間、運動后的血糖、心跳和血壓。

由表3可知，服用大蒜黃酮之后，運動員的各項身體機能都得到了一定程度的提升，說明大蒜黃酮具有一定的抗疲勞功效。

表3 服用大蒜黃酮化合物前后運動員體征變化Table 3 Changes of athletes' physical signs before and after taking garlic flavonoids

4 結(jié)論

隨著社會的進步，黃酮在治療人類疾病方面的功效開始被重視，黃酮的開發(fā)和提取已經(jīng)在很多植物中被報道，但是在大蒜中的研究報道相對缺乏。本研究基于此，采用有機溶劑提取法、單因素試驗法和正交試驗法對大蒜中的黃酮提取進行研究，單因素研究結(jié)果表明，最佳的黃酮提取工藝為液料比70∶1，水浴時間3.5 h，水浴溫度50 ℃和乙醇濃度60%；正交試驗研究結(jié)果表明，最佳的黃酮提取工藝為液料比65∶1，乙醇濃度50%，水浴時間3.5 h和水浴溫度50 ℃。此外，大蒜黃酮表現(xiàn)出一定的抗疲勞活性。