瘺管法在氨基酸消化率評(píng)定中的研究與應(yīng)用

■余可佳 李玉蓮 易學(xué)武 范志勇*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湘潭市家畜育種站，湖南 湘潭 411100；3.湖南美龍飼料科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

飼料氨基酸生物利用率的準(zhǔn)確測(cè)定是評(píng)定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要手段，對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究及其之后的飼料配方設(shè)計(jì)參數(shù)選擇影響巨大。根據(jù)食糜收集方法的不同，豬飼料氨基酸消化率的測(cè)定主要有糞便分析法和回腸末端食糜取樣兩種代表性操作方法，考慮到豬后腸微生物發(fā)酵對(duì)飼料有效氨基酸含量的干擾和破壞，氨基酸消化率應(yīng)在回腸末端取樣測(cè)定的觀點(diǎn)得到了廣泛認(rèn)可。為準(zhǔn)確獲取飼料蛋白質(zhì)氨基酸的回腸末端含量，結(jié)合荷術(shù)豬的生理狀況、操作流程及其后續(xù)護(hù)理等影響因素，與屠宰法和回直腸吻合術(shù)（ileorectal anastomosis，IRA）相比，Cunningham首創(chuàng)，經(jīng)Dierick改進(jìn)完善的簡(jiǎn)單T型瘺管法，以其操作簡(jiǎn)單、護(hù)理容易、取樣影響小以及食糜阻塞和滲漏現(xiàn)象較少發(fā)生等優(yōu)勢(shì)，得到了充足發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已成為現(xiàn)代測(cè)定豬飼料氨基酸利用率的首選方法。經(jīng)前人不斷地實(shí)踐與探索，總結(jié)出了T型瘺管和橋型瘺管兩種體系。

1 瘺管法概述

1.1 工作原理

瘺管法是利用手術(shù)措施給動(dòng)物安裝不同的瘺管，收集各種液體和食糜進(jìn)行觀測(cè)和樣品分析的方法。最初是在巴浦洛夫開(kāi)展的消化液分泌條件反射試驗(yàn)中，為觀察狗的消化液生理分泌節(jié)律，切斷食管安裝瘺管采取的一種手術(shù)操作和樣品采集方法[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逐漸發(fā)展到多個(gè)領(lǐng)域，其中，腸道瘺管（如回腸瘺管）技術(shù)已成為豬飼料蛋白質(zhì)氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值準(zhǔn)確評(píng)定的有效方法。

T型瘺管法是通過(guò)外科手術(shù)在腸道內(nèi)處安裝1個(gè)T 型瘺管；橋型瘺管則是在腸道2 個(gè)不同部位分別安裝1個(gè)T型瘺管，然后用1個(gè)橋型玻璃管將二者相連，因其形狀故此得名[2]。二者相同之處都是在腸道某一處安裝瘺管，通過(guò)瘺管收集樣品。其差別在于，T 型瘺管法為點(diǎn)取樣法，樣品氨基酸測(cè)定的準(zhǔn)確性和操作流程可以較好地控制，但取樣繁瑣、瘺管易脫落、必須結(jié)合指示劑法以及兼顧多個(gè)影響因素[3]；而橋型瘺管法屬于定量取樣，樣本更具有代表性，可不使用指示劑，但瘺管更容易脫落、術(shù)后護(hù)理難度更大、瘺管之間連接處由于材質(zhì)和安裝問(wèn)題也更易于發(fā)生堵塞[4]。因此，具體應(yīng)用過(guò)程中，要根據(jù)現(xiàn)實(shí)情況，充分考慮飼糧、動(dòng)物和樣品因素，選擇合適的瘺管以期達(dá)到最佳效果。常用消化道瘺管安裝方法如圖1所示。

圖1 瘺管安裝示意圖

1.2 T型瘺管法

Cunningham等[5]自1963年首創(chuàng)了簡(jiǎn)單T型瘺管法（simple T-cannulas，STC），在回盲瓣前5～10 cm 的回腸末端處植入瘺管，手術(shù)的過(guò)程及護(hù)理比較簡(jiǎn)單，取樣時(shí)對(duì)消化道功能影響較小，但不能收集全部的回腸食糜且須使用指示劑。經(jīng)過(guò)不斷地進(jìn)行理論深化與技術(shù)改進(jìn)，Van Leeuwen等[6]在STC的基礎(chǔ)上發(fā)明了瓣后T型瘺管法（post valve T-cannulas，PVTC），PVTC法切除了部分盲腸，增大了瘺管口徑，將瘺管安裝在回盲瓣后剩余的盲腸內(nèi)即可收集回腸食糜，但仍需使用指示劑。隨后Morz 等[7]提出了可操縱回盲瓣T 型瘺管法（steered ileo-caecal valve，SICV），SICV 是一種更新的用于定量化收集回腸食糜的取樣方法，用兩個(gè)不銹鋼環(huán)使回盲瓣可移動(dòng)，在內(nèi)環(huán)系上一根尼龍繩經(jīng)腸腔到瘺管口牽引出體外。平時(shí)食糜流動(dòng)方向正常，在采樣時(shí)，通過(guò)收緊兩個(gè)環(huán)使得回腸食糜能夠完全通過(guò)T型瘺管，從而達(dá)到全收樣的目的，這種方法無(wú)需使用指示劑，且較少出現(xiàn)食糜阻塞現(xiàn)象，不過(guò)手術(shù)安裝復(fù)雜，對(duì)手術(shù)人員的技術(shù)要求很高，使用壽命不長(zhǎng)，如不將回盲瓣完全拉入瘺管內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致消化率評(píng)估值變高。前兩者屬于點(diǎn)取樣法，需要使用指示劑，后者屬于定量取樣法，不需要使用指示劑，三者手術(shù)難度依次增加，測(cè)定值的準(zhǔn)確性也依次提高。

1.3 橋型瘺管法

根據(jù)近端瘺管的安裝位置可分為瓣前橋型瘺管法和瓣后橋型瘺管法，根據(jù)遠(yuǎn)端瘺管位置又可分為回回橋型瘺管法、回盲橋型瘺管法、回結(jié)橋型瘺管法和回直橋型瘺管法，其中回盲橋型瘺管法是應(yīng)用最多的。由于瓣前橋型瘺管法切除了部分腸道，干擾了肌—電興奮的正常傳遞，使得回盲瓣正常功能喪失且瘺管易脫落[2]。Darcy等[8]發(fā)明的瓣后橋型瘺管法在操作過(guò)程中需要切除大部分盲腸，將近端瘺管安裝于切除后剩余的盲腸內(nèi)，回盲瓣保持正常功能，在回腸食糜正常到達(dá)結(jié)腸部位時(shí)正常取樣，利用此種方法可以測(cè)定粗顆粒的高纖維日糧的消化率，且不會(huì)發(fā)生食糜阻塞現(xiàn)象。印遇龍[9]對(duì)橋型瘺管法進(jìn)行了更加深入的試驗(yàn)研究，通過(guò)改進(jìn)手術(shù)方案和術(shù)后護(hù)理方法，極大地提高了手術(shù)的成功率，為后續(xù)的科學(xué)研究提供了有價(jià)值的參考。

2 瘺管法在豬飼料氨基酸消化率測(cè)定中的應(yīng)用

2.1 瘺管法豬飼料氨基酸消化率的評(píng)價(jià)

簡(jiǎn)單T 型瘺管法因其操作簡(jiǎn)單、重演性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于豬飼料回腸氨基酸消化率的測(cè)定。吳士博等[10]給三元雜交生長(zhǎng)豬安裝簡(jiǎn)單T 型瘺管，測(cè)定4個(gè)品種飼料稻糙米的表觀回腸氨基酸消化率（AID）和標(biāo)準(zhǔn)回腸氨基酸消化率（SID），結(jié)果表明測(cè)定結(jié)果均高于中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表的推薦值。董文軒等[11]給三元雜交豬安裝T 型瘺管，測(cè)定不同存儲(chǔ)時(shí)間小麥的氨基酸表觀回腸消化率，結(jié)果表明儲(chǔ)存時(shí)間顯著影響小麥的氨基酸表觀回腸消化率，儲(chǔ)存1年后的小麥對(duì)生長(zhǎng)豬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最佳，隨著儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越低。Fuller等[12]試驗(yàn)結(jié)果顯示PVTC測(cè)定的大麥蛋白與干燥奶制品兩種原料蛋白質(zhì)消化率均高于STC。Morz等[7]將SICV與PVTC兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)SICV測(cè)定的干物質(zhì)、有機(jī)物和粗蛋白的回腸末端表觀消化率比PVTC 的測(cè)定值低，這與SICV 法收集全部回腸食糜與不使用指示劑密切相關(guān)。其能被業(yè)內(nèi)接受并認(rèn)可的另一原因是測(cè)值準(zhǔn)確性較高，從表1可知，3處不同數(shù)據(jù)來(lái)源所報(bào)道的玉米和豆粕的回腸表觀氨基酸消化率，張晉輝等[13]和Sauer等[14]報(bào)道的玉米和豆粕兩類(lèi)飼料原料的必需氨基酸消化率處于中國(guó)飼料數(shù)據(jù)庫(kù)的推薦值范圍之內(nèi)，其中，Sauer等[14]的試驗(yàn)結(jié)果顯示玉米的必需氨基酸消化率均高于張晉輝等[13]的測(cè)定值，然而二者在測(cè)定豆粕的必需氨基酸消化率中，除纈氨酸和苯丙氨酸相差較大外，其他必需氨基酸消化率值非常接近，總體而言，Sauer 等[14]的試驗(yàn)結(jié)果與中國(guó)飼料數(shù)據(jù)庫(kù)的推薦值更為接近，表明瘺管法測(cè)定氨基酸消化率是可普遍應(yīng)用且結(jié)果是可信的。

表1 豬飼料回腸氨基酸表觀消化率比較（%）

由于T型瘺管法在應(yīng)用中存在無(wú)法忽視的弊端，如必須使用指示劑，在很大程度上影響了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。存在一種趨勢(shì)是兩種瘺管法被用來(lái)測(cè)定谷物和豆粕復(fù)合飼料的消化率時(shí)，觀察到兩種瘺管技術(shù)之間存在差異，但評(píng)定單一飼料時(shí)，二者幾乎沒(méi)有差異[15]。專(zhuān)家學(xué)者們將橋型和T型瘺管法進(jìn)行了比較試驗(yàn)，如印遇龍[16]的試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定單一植物性飼料和粗蛋白含量較低的混合飼糧的蛋白質(zhì)和氨基酸消化率時(shí)，T型瘺管法的測(cè)定結(jié)果高于橋型瘺管法；而測(cè)定高含量粗蛋白飼糧時(shí)結(jié)果相反，且T型瘺管法變異系數(shù)＞25%，橋型瘺管法＜8%，表明與T型瘺管法相比，橋型瘺管法測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。綜上所述，橋型瘺管法是全取樣法，不需要使用指示劑，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，但手術(shù)操作和術(shù)后護(hù)理難度較大；而T型瘺管法（尤其是簡(jiǎn)單T型瘺管法）對(duì)動(dòng)物本身的生理狀態(tài)影響較小，且手術(shù)操作和術(shù)后護(hù)理都更為簡(jiǎn)單，但也存在測(cè)定值不夠精確、需要使用指示劑等問(wèn)題。迄今為止，在實(shí)際日糧營(yíng)養(yǎng)成分分析中，應(yīng)用得最廣泛的還是簡(jiǎn)單T型瘺管法，在具體的應(yīng)用中試驗(yàn)人員還需根據(jù)自己的試驗(yàn)要求和目的等因素選擇合適的方法。

2.2 影響瘺管法測(cè)定氨基酸消化率的因素分析

2.2.1 飼糧因素

研究表明，對(duì)進(jìn)行瘺管手術(shù)后恢復(fù)良好的荷術(shù)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，瘺管的插入對(duì)動(dòng)物腸道干物質(zhì)和能量的消化率并無(wú)影響[17-18]，換言之，安裝瘺管本身對(duì)動(dòng)物腸道消化率影響很小，影響消化率的因素應(yīng)著重考慮飼糧或動(dòng)物等其他因素更為實(shí)際。

飼糧因素是影響瘺管法測(cè)定氨基酸消化率的重要因素之一，飼料原料的氨基酸組成比例、粗蛋白水平、抗?fàn)I養(yǎng)因子及飼料成熟度等因素導(dǎo)致不同飼料蛋白質(zhì)消化率存在差異[19]。研究表明，粗蛋白水平較高的飼糧對(duì)生長(zhǎng)豬的飼喂價(jià)值更高[19]，含乳成分飼糧的氨基酸表觀消化率高于大麥飼糧，其中以賴(lài)氨酸表觀消化率差異最大[12]。Adeola 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧粗蛋白含量從68 g/kg提高到214 g/kg時(shí)，多種必需氨基酸和非必需氨基酸的AID 呈線性增加，與Fan 等[22]的試驗(yàn)結(jié)果相同。劉正群[23]給閹公豬回腸末端安裝簡(jiǎn)單T型瘺管探討不同粗蛋白水平是否對(duì)生長(zhǎng)豬AID和SID產(chǎn)生影響，試驗(yàn)結(jié)果表明不同粗蛋白水平顯著影響生長(zhǎng)豬氨基酸（AA）的AID，多數(shù)AA 的AID 會(huì)隨著粗蛋白水平的提高呈線性增加，其增加值可從3.70%[酪氨酸（Tyr）]變化到38.25%[脯氨酸（Pro）]，而對(duì)生長(zhǎng)豬的SID 并無(wú)顯著影響。Otto 等[24]研究表示，飼糧粗蛋白水平在滿(mǎn)足動(dòng)物需求的基礎(chǔ)上繼續(xù)提高時(shí)，多數(shù)氨基酸的AID會(huì)呈線性降低，說(shuō)明粗蛋白的添加水平需在適宜范圍，并不是越高越好。K?hler[25]表示飼糧干物質(zhì)的消化率影響氨基酸的消化率，采用IRA 和PVTC法收集試驗(yàn)豬3、9、12周的回腸食糜，結(jié)果表明，IRA-豬的干物質(zhì)表觀回腸消化率顯著高于PVTC-豬，但除Thr外，IRA-豬其他必需氨基酸消化率均低于PVTC-豬。另有文獻(xiàn)報(bào)道，飼糧中粗纖維濃度對(duì)豬飼糧氨基酸消化率的影響同樣不可忽視，一般來(lái)說(shuō)，飼糧纖維濃度越高，蛋白質(zhì)和氨基酸的消化率越低，原因在于飼料提供的纖維成分抑制了消化酶的活性以及消化酶與腸道食糜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的酶促反應(yīng)[26]。Dilger 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，中性洗滌纖維含量每增加1%，飼糧中粗蛋白和氨基酸的AID 降低0.3%～0.8%。李鐵軍等[28]和Zhao 等[29]認(rèn)為飼糧中纖維的來(lái)源和成分比飼糧纖維的含量對(duì)回腸內(nèi)源氨基酸損失的影響更大。

2.2.2 動(dòng)物因素

不同動(dòng)物品種、體重和生理階段的回腸氨基酸消化率均有所不同。Mariscal-Landin 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬的氨基酸回腸基礎(chǔ)內(nèi)源損失顯著高于生長(zhǎng)豬。Presto 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，體重為25.9 kg 的生長(zhǎng)豬的內(nèi)源氨基酸損失高于體重93.2 kg的生長(zhǎng)豬。亦有報(bào)道稱(chēng)不同生長(zhǎng)階段的豬氨基酸消化率也存在差異，如生長(zhǎng)閹公豬Lys 消化率的范圍在52.27%～84.31%[32]，而斷奶仔豬Lys 消化率的范圍在79.92%～88.62%[33]。王磊[34]對(duì)比了長(zhǎng)白豬、大白×太湖二元雜交豬（以下簡(jiǎn)稱(chēng)大太二雜豬）和太湖豬的飼糧養(yǎng)分消化率，結(jié)果表明，大太二雜豬對(duì)飼糧干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪以及能量的消化率都高于長(zhǎng)白豬和太湖豬，而長(zhǎng)白豬和太湖豬在飼糧干物質(zhì)、粗蛋白和總能上的消化率并無(wú)顯著差異。其中緣由可追溯到出生初期，觀察到大太二雜豬胃的相對(duì)重量和小腸長(zhǎng)度都極顯著高于長(zhǎng)白豬和太湖豬，可能是由于雜交優(yōu)勢(shì)表達(dá)出了大太二雜豬優(yōu)于其他豬種的營(yíng)養(yǎng)消化率和生活力。但Stein 等[35]表示，動(dòng)物的年齡、體重和生理狀態(tài)對(duì)單位干物質(zhì)采食量的回腸內(nèi)源氨基酸損失影響很小。

2.2.3 取樣方法

不同瘺管體系的取樣方法導(dǎo)致結(jié)果差異較大，T型瘺管法需結(jié)合指示劑法，指示劑法本身存在分析方法上的誤差，在取樣時(shí)會(huì)有過(guò)高比例的三氧化二鉻（Cr2O3）和沒(méi)有完全消化的食糜微粒涌出，導(dǎo)致消化率測(cè)定不準(zhǔn)確[3]，是T 型瘺管法的弊端。研究表明指示劑種類(lèi)會(huì)影響豬氨基酸的內(nèi)源損失，且與飼糧類(lèi)型有聯(lián)合作用[36]，Jagger等[37]和Favero等[38]也表示不同纖維水平和添加植酸酶與指示劑種類(lèi)之間也存在相互作用。另外，在不同時(shí)間段收集的食糜，其Cr2O3、氨基酸以及蛋白質(zhì)的含量差異很大，使得測(cè)值變異系數(shù)加大，Granam等[39]認(rèn)為動(dòng)物食糜排出具有晝夜間歇的特點(diǎn)，通過(guò)簡(jiǎn)單T型瘺管法很難一次性收集到有代表性的樣品。劉成玲等[40]對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)使用T型瘺管法收集生長(zhǎng)豬回腸末端食糜及指示劑的流量在日內(nèi)采樣時(shí)間上有顯著差異，連續(xù)收集16 h的回腸食糜發(fā)現(xiàn)，總能與粗蛋白的總量占全天流經(jīng)回腸末端的68%以上，且這一比例日間差異不顯著，Cr2O3在日間相對(duì)穩(wěn)定，回收率在69%以上，說(shuō)明16 h收集的食糜具有一定的代表性。

2.2.4 其他

直接法和差異法計(jì)算飼糧氨基酸消化率結(jié)果存在差異，Oliveira 等[41]試驗(yàn)結(jié)果表示，用直接法計(jì)算玉米和小麥的Trp，兩者的AID沒(méi)有區(qū)別；但使用差異法計(jì)算，小麥的Trp的AID顯著高于玉米。此外，試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)食糜滲漏、瘺管堵塞以及術(shù)后護(hù)理不當(dāng)導(dǎo)致豬死亡等問(wèn)題均會(huì)影響試驗(yàn)的進(jìn)程和結(jié)果。

3 結(jié)語(yǔ)

T型瘺管法具有取樣方便、手術(shù)過(guò)程簡(jiǎn)單、術(shù)后易護(hù)理等優(yōu)勢(shì)，但取樣代表性差、測(cè)定結(jié)果不夠精確；橋型瘺管法測(cè)定更精確，但手術(shù)過(guò)程和術(shù)后護(hù)理更困難、對(duì)手術(shù)人員要求很高，操作或護(hù)理不當(dāng)易造成豬死亡。在實(shí)際測(cè)定豬回腸末端氨基酸消化率時(shí)，簡(jiǎn)單T型瘺管法的應(yīng)用更加廣泛，如果長(zhǎng)期研究高纖維飼糧氨基酸消化率，宜選擇橋型瘺管法，但試驗(yàn)成本更高。