辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠血脂及肝臟的影響

王 宏，劉 月，饒 露，蔡榮珊，宋婷婷，賀震旦，徐應(yīng)淑，熊永愛(ài)

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000； 2.深圳技術(shù)大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 深圳 518118)

高脂血癥(hyperlipidemia, HLP) 是由于脂代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常，使血漿中一種或幾種脂質(zhì)高于正常范圍的代謝性疾病[1]。HLP常表現(xiàn)為高膽固醇血癥(含量>230 mg/100 mL)、高甘油三酯血癥(含量>140 mg/100 mL)或兩者兼有的混合型高脂血癥[2-3]。由于大部分脂質(zhì)與血漿蛋白結(jié)合而在全身運(yùn)轉(zhuǎn)，故高脂血癥常反映于高脂蛋白血癥(β-脂蛋白>390 mg/100 mL)，其是動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病和脂肪肝的主要原因。因此，預(yù)防和治療HLP仍然是全球公共衛(wèi)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。HLP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，如炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1等異常升高[4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)效應(yīng)[5]，腸道菌群紊亂[6]，過(guò)度氧化應(yīng)激[7]等均被報(bào)道與HLP發(fā)病相關(guān)。

辣木籽為辣木科(Moringaceae)辣木屬(Moringaadans)植物辣木樹(shù)的種子，具有廣泛的食用和藥用價(jià)值[8-10]。辣木籽原產(chǎn)于印度，根據(jù)《印度阿育吠托藥典》中的記載，辣木籽味甘、性涼，具有祛風(fēng)、利膽、去脂肪、止痛、殺腹蟲(chóng)、潤(rùn)膚、明目、清腦等功效，已有近千年的食用歷史。辣木樹(shù)在熱帶、亞熱帶地區(qū)均有種植。20世紀(jì)初辣木樹(shù)從緬甸被引種到我國(guó)云南省芒市，開(kāi)始大面積種植，近年來(lái)我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)均對(duì)其開(kāi)展了大量種植，其根、莖、花、葉、籽均可入藥，目前國(guó)內(nèi)外研究主要聚焦在葉和籽。辣木葉于2012年被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，近年來(lái)其化學(xué)成分和生物活性被國(guó)內(nèi)外廣泛研究。辣木籽不僅含有豐富的油脂，還含有其他多種天然活性成分，如生物堿、皂苷、單寧、甾體、酚酸、硫代葡萄糖苷、異硫氰酸鹽、硫代氨基甲酯、黃酮類(lèi)化合物和萜類(lèi)化合物[11-12]，具有降低血脂、血糖，增強(qiáng)人體免疫，殺菌，抗氧化，抗病毒等生理功能[13-14]。已有的文獻(xiàn)報(bào)道主要是辣木籽及其油脂營(yíng)養(yǎng)成分等方面的研究，而尚無(wú)關(guān)于辣木籽提取物在降脂方面的研究?；诖?，本研究建立高脂血癥小鼠模型，通過(guò)灌胃不同劑量辣木籽提取物，測(cè)定血脂指標(biāo)和肝臟指標(biāo)的變化，明確辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠模型的降脂作用，為辣木籽提取物的深度開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄混裝，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 原料與試劑

辣木籽(批號(hào)20190808)，義烏市啟吉食品有限公司;基礎(chǔ)飼料、高脂飼料(豬油10%+蔗糖20%+膽固醇2.5%+膽酸鈉1%)，上海達(dá)燊實(shí)業(yè)有限公司；辛伐他汀片 (批號(hào)79902-63-9，給藥前用雙蒸水配制成1 mg/mL的混懸液)，成都恒瑞制藥有限公司；聚HRP抗兔lgG抗體(貨號(hào)SP034)，北京市索萊寶公司；石油醚(分析純)，成都金山化學(xué)試劑有限公司；GF254薄層層析硅膠(化學(xué)純)，青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)；TC試劑盒(貨號(hào)ARB13130)、TG試劑盒(貨號(hào) ARB12866)、LDL-C試劑盒(貨號(hào)ARB13019)、HDL-C試劑盒(貨號(hào)ARB13211)、小鼠FXR多克隆抗體(貨號(hào)IMG-30131)，艾美捷科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；微量高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；KX-21型全自動(dòng)血清分析儀，日本Sysmex公司；Leica RM2235型病理切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司；CX43型電子顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣木籽提取物的制備

取1 kg干燥辣木籽，稱(chēng)量后粉碎至細(xì)粉，用85%的甲醇回流提取兩次，每次1.5 h，合并提取液，減壓回收甲醇至干，加入粒徑0.165～0.198 mm(80～100目)硅膠拌樣，然后用硅膠柱上樣，用石油醚進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓回收石油醚，即得辣木籽提取物(得率約為15%)。

1.2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

將60只SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，辛伐他汀組(1 mg/kg)，辣木籽提取物低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)劑量組，每組10只。除正常組飼喂基礎(chǔ)飼料外，其余各組小鼠以高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第6周開(kāi)始，除正常組和模型組外，其余各組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)3周。正常組和模型組灌胃相同體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)最后1 d，各組小鼠眼球取血，用裝有抗凝劑 EDTA-Na2的EP管收集，再于3 000 r/min離心10 min，收集上清液(血清)，在-20℃冷凍保存，待測(cè)。而后斷頸處死小鼠，剖取肝臟，生理鹽水沖洗，稱(chēng)其質(zhì)量。取部分肝臟組織固定在4%多聚甲醛中，剩余肝臟組織保存于液氮中，待測(cè)。

1.2.3 小鼠體質(zhì)量測(cè)定

分別于實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4、5、6、7、8周稱(chēng)取各組小鼠體質(zhì)量，并觀察給藥后各組小鼠體質(zhì)量變化。

1.2.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

用全自動(dòng)血清分析儀測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.2.5 肝臟指數(shù)測(cè)定

采血結(jié)束后，稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量；斷頸處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠，剖取肝臟，生理鹽水沖洗，稱(chēng)量肝臟質(zhì)量。計(jì)算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)為肝臟質(zhì)量占小鼠體質(zhì)量的比例)。

1.2.6 病理形態(tài)學(xué)觀察

切取各實(shí)驗(yàn)組小鼠相同部位的部分肝臟組織于10%中性甲醛固定48 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片后，采用 HE 染色法進(jìn)行肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察，并對(duì)其進(jìn)行病理評(píng)分[15]：肝細(xì)胞形態(tài)整齊，肝細(xì)胞索排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，為0分；肝細(xì)胞索排列紊亂，偶見(jiàn)脂滴空泡，有輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為1分；肝細(xì)胞有輕度腫脹，較多脂滴空泡或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，為2分；肝竇消失，肝細(xì)胞重度腫脹，有大量脂滴空泡或炎性浸潤(rùn)，為3分；肝細(xì)胞大面積空泡樣病變并有炎性壞死，為4分。

1.2.7 肝臟組織FXR蛋白表達(dá)

采用免疫組化法對(duì)各組小鼠肝臟法尼酯X受體(FXR)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。采用 4%多聚甲醛固定的小鼠肝臟，對(duì)其進(jìn)行包埋，制成石蠟切片。經(jīng)脫蠟、水化，并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶活性后，用小鼠FXR多克隆抗體在4℃以1∶200稀釋?zhuān)豢狗跤^(guò)夜。隨后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，用 PV-9002兩步法和聚 HRP 抗兔 IgG 抗體檢測(cè)FXR蛋白的表達(dá)。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，應(yīng)用Image J 圖像分析軟件進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野, 每個(gè)視野內(nèi)觀察100個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞不小于10%判定為陽(yáng)性, 否則為陰性，并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞FXR的平均光密度值(AOD)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組間采用單因素方差分析，方差齊者組間進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，方差不齊者進(jìn)行Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以p<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并以GraphPad Prism 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠體質(zhì)量的影響(見(jiàn)圖1)

圖1 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠體質(zhì)量的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各組小鼠生長(zhǎng)狀況均良好。由圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)第8周，辣木籽提取物中、高劑量組和辛伐他汀組小鼠體質(zhì)量較模型組有所減輕,但差異不顯著。

2.2 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠血清生化指標(biāo)的影響(見(jiàn)圖2)

注：與模型組比較, *為p<0.05, **為p<0.01。下同

由圖2可知，與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均極顯著升高(p<0.01)，HDL-C水平極顯著降低(p<0.01)，說(shuō)明造模成功。與模型組比較，辛伐他汀組及辣木籽提取物各劑量組小鼠TC、TG、LDL-C水平均顯著降低(p<0.05)，HDL-C水平極顯著升高(p<0.01)。結(jié)果表明，不同劑量的辣木籽提取物能明顯改善高脂血癥模型小鼠血清中脂代謝異常的常見(jiàn)生化指標(biāo)。

2.3 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟指數(shù)的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟指數(shù)的影響

由圖3可知，與正常組比較，模型組的肝臟指數(shù)顯著升高(p<0.05)。與模型組比較，辣木籽提取物低劑量組及辛伐他汀組的肝臟指數(shù)顯著降低(p<0.05)。辣木籽提取物不同劑量之間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，低劑量降低肝臟指數(shù)的效果更加明顯。結(jié)果表明，低劑量的辣木籽提取物具有顯著降低高脂血癥小鼠肝臟指數(shù)的作用(p<0.05)。

2.4 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)及病理評(píng)分的影響(見(jiàn)圖4～圖5)

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組。下同

注：與模型組比較, **為p<0.01

由圖4可知，正常組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)正常，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，大小均勻，染成藍(lán)色的細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見(jiàn)病理變化。模型組小鼠肝細(xì)胞索排列紊亂，呈肝彌散性脂肪病變，表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴空泡，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹呈氣球樣變，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，辛伐他汀組和辣木籽提取物高、中、低劑量組小鼠肝臟組織氣球樣變和腫脹程度明顯減輕，肝細(xì)胞炎癥灶減少，范圍明顯縮小。結(jié)果表明，辣木籽提取物對(duì)高脂血癥介導(dǎo)的肝臟脂肪病變具有一定的改善作用。

由圖5可知，與模型組相比，辣木籽提取物低、中、高劑量組小鼠肝臟組織病理評(píng)分極顯著降低(p<0.01)，病理評(píng)分由高到低依次為模型組>辣木籽提取物(高、中、低劑量)組>辛伐他汀組>正常組。不同劑量辣木籽提取物對(duì)比發(fā)現(xiàn)，低劑量辣木籽提取物降低小鼠肝臟組織病理評(píng)分的效果更加明顯。結(jié)果表明，辣木籽提取物具有極顯著降低高脂血癥小鼠肝臟病理評(píng)分的作用。

2.5 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織FXR蛋白表達(dá)的影響(見(jiàn)圖6～圖7)

圖6 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織FXR蛋白表達(dá)的影響(IHC，200×)

圖7 辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織FXR蛋白表達(dá)的影響

FXR是膽汁酸(Bile acids，BA)反應(yīng)性配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體超家族的成員[16]。FXR 蛋白在控制 BA 動(dòng)態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用，是 BA 穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子[17]。此外，小異源二聚體伴侶(SHP)是一種受 FXR 直接調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄阻遏物，通過(guò) FXR-SHP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)表達(dá)[18], 而膽固醇-7α-羥化酶可催化膽固醇分解為 BA，最終導(dǎo)致 BA 合成減少。FXR被證明可通過(guò)多種途徑參與調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝和糖代謝，參與一系列代謝性疾病如高脂血癥、2型糖尿病等的發(fā)生發(fā)展。因此，抑制 FXR 蛋白的活性或表達(dá)能促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的分解代謝，從而調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。

肝臟組織中FXR蛋白出現(xiàn)褐色染色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。由圖6、圖7可知，與正常組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞增加，平均光密度值極顯著增大(p<0.01)。與模型組比較，辣木籽提取物低、中劑量組小鼠肝臟組織中陽(yáng)性細(xì)胞減少，平均光密度值顯著降低(p<0.05)，而辣木籽提取物高劑量組小鼠肝臟組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均光密度值與模型組比較無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，一定劑量的辣木籽提取物可不同程度地下調(diào)FXR蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)體內(nèi)膽固醇的分解代謝，調(diào)節(jié)血清中脂質(zhì)水平，這可能是辣木籽提取物產(chǎn)生調(diào)節(jié)血脂作用的潛在靶點(diǎn)。

3 結(jié) 論

通過(guò)研究辣木籽提取物對(duì)高脂血癥小鼠血脂及肝臟的影響發(fā)現(xiàn)，低劑量辣木籽提取物能顯著改善高血脂小鼠模型血清中常見(jiàn)生化指標(biāo)的脂代謝異常及肝臟指數(shù)，同時(shí)顯著下調(diào)小鼠肝臟組織 FXR 蛋白表達(dá)，說(shuō)明一定劑量的辣木籽提取物對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠高脂血癥具有良好的防治作用，可有效降低高脂血癥小鼠血脂水平，并對(duì)其肝臟具有明顯的保護(hù)作用。