松材線蟲病研究進(jìn)展

葉建仁，吳小芹

(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

1 松材線蟲病的發(fā)生概況

松材線蟲病(pine wilt disease，PWD)又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus(Steiner ＆Buhrer)Nickle 引起的一種系統(tǒng)侵染性病害，主要危害松屬Pinus植物，亦可危害少數(shù)非松屬針葉樹，如長白落葉松Larix olgensis。

北美洲被認(rèn)為是松材線蟲的原產(chǎn)地[1－3]。1934 年，美國藍(lán)變松木中發(fā)現(xiàn)松材線蟲，但并未引起明顯損失，故沒有引起重視，直到1979 年才報(bào)道松材線蟲在美國引起松樹死亡，廣泛調(diào)查后發(fā)現(xiàn)在美國和加拿大等北美洲的鄉(xiāng)土松樹上，松材線蟲并不引起明顯損害，對一些外來松樹才引起死亡[4]。松材線蟲病在北美洲主要影響松木及其產(chǎn)品出口，據(jù)統(tǒng)計(jì)因松材線蟲病導(dǎo)致的進(jìn)出口限制使得美國每年損失約1.5 億美元，加拿大損失7 億美元[5]。

日本是有文獻(xiàn)記載的最早遭受松材線蟲病危害，且引起松樹大量死亡的國家。 1905 年發(fā)現(xiàn)日本九州島長崎縣松樹大量死亡[6]。 隨后數(shù)十年松材線蟲病在日本由南向北傳播蔓延，1982 年傳到東北部的秋田縣，隨后，除了北海道和青森縣，幾乎各縣都發(fā)生了松材線蟲病，每年發(fā)生面積約占全國松林面積30%。 20 世紀(jì)，松材線蟲病在日本造成松樹大量死亡，1979 年松樹發(fā)病面積達(dá)67 萬hm2，損失木材240 萬m3[2]。 日本的鄉(xiāng)土樹種黑松Pinus thunbergii、赤松P.densiflora、硫球松P.luchuensis和日本五針?biāo)蒔.parviflora等都高度易感。 普遍認(rèn)為日本發(fā)生的松材線蟲病最初是由北美洲傳入，由美國傳入的可能性最大[1，3，7－9]。 日本大多數(shù)地區(qū)的氣候條件都十分有利于該病害流行，日本是近百年來松材線蟲病流行最嚴(yán)重的國家之一[10]。

中國是目前松材線蟲病流行最嚴(yán)重的國家。1982 年首次在江蘇省南京市中山陵發(fā)現(xiàn)松材線蟲病引起265 株黑松死亡的現(xiàn)象，同年在中國香港的馬尾松Pinus massoniana上也確定發(fā)生了松材線蟲病，1983 年在中國臺灣省臺北縣硫球松上發(fā)生松材線蟲病[11]。 40 年來，該病害在中國不斷發(fā)展，2021年全國共有19 個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)742 個(gè)縣級行政區(qū)發(fā)生疫情，發(fā)生面積171.65 萬hm2[11]。

在自然情況下全球可以感染松材線蟲病的松屬樹種至少51 種，非松屬樹種至少16 種。 目前在中國自然感病的樹種至少17 種，包括黑松、赤松、馬尾松、 琉 球 松， 白 皮 松Pinus bungeana、 黃 山 松P.taiwanensis、濕地松P.elliottii、思茅松P.kesiya、云 南 松P.yunnanensis、 火 炬 松P.taeda、 油 松P.tabuliformis、華山松P.armandii、紅松P.koraiensis、樟子松P.sylvestrisvar.mongolica、長白落葉松、日本落葉松Larix kaempferi、華北落葉松L.principis-rupprechtii[12－15]。

松材線蟲病1982 年在中國南京最初發(fā)生時(shí)，黑松和赤松是主要受害樹種，鄉(xiāng)土樹種馬尾松開始比較抗病，一度認(rèn)為馬尾松抗松材線蟲病。 然而，1986年以后松材線蟲病開始引起江蘇馬尾松整株死亡，1988 年安徽和廣東發(fā)生松材線蟲病的林分中有成片的馬尾松染病死亡，1991 年浙江發(fā)生松材線蟲病，馬尾松大面積受害。 顯然與黑松和赤松一樣，在中國分布最廣、面積最大的馬尾松對松材線蟲病也是高度或中度感病的。 關(guān)于在病害傳入初期中國馬尾松抗性發(fā)生變化的原因，筆者認(rèn)為短短幾年里馬尾松本身的抗性基礎(chǔ)是不會變化的，變化的應(yīng)該是在這一時(shí)期松材線蟲的種群組成和適應(yīng)性。 研究表明中國的松材線蟲最初最大可能是由日本傳入的[16－17]。 當(dāng)松材線蟲剛從日本傳入中國時(shí)，其群體對黑松和赤松最適應(yīng)，致病力最強(qiáng)，對馬尾松則是不太適應(yīng)的。 幾年后，能適應(yīng)馬尾松的松材線蟲群體漸漸形成，此時(shí)馬尾松才由初期的抗病慢慢變成易感病[12]。

韓國1988 年10 月在釜山市首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，發(fā)病面積約100 hm2。 2000 年后病害快速擴(kuò)散，至2006 年危害面積達(dá)7 871 hm2。 目前韓國大部分地區(qū)都已發(fā)生，累計(jì)病死樹達(dá)2 000 多萬株，主要危害的樹種為赤松、黑松和紅松[18]。

歐洲1999 年首次在葡萄牙南部海岸松Pinus pinaster上發(fā)現(xiàn)松材線蟲病[19]，2008 年病害在葡萄牙中部和北部多個(gè)點(diǎn)同時(shí)暴發(fā)。 此后西班牙進(jìn)行全國性病害普查，在西班牙與葡萄牙接壤地區(qū)的松林中發(fā)現(xiàn)了松材線蟲病[20]，主要發(fā)生在歐洲赤松Pinus sylvestris、矮赤松P.mugo、海岸松和歐洲黑松P.nigra上[21－22]。 Valadas 等認(rèn)為歐洲松材線蟲的種群總體上與亞洲的種群遺傳更為相似[23]。

雖然在非洲或南美洲也有一些關(guān)于傘滑刃屬Bursaphelenchus線蟲的報(bào)道[24－25]，20 世紀(jì)90 年代尼日利亞也發(fā)現(xiàn)了松材線蟲[26]，但是沒有關(guān)于這些地區(qū)發(fā)生松材線蟲病的報(bào)道。

松材線蟲病在亞洲的鄉(xiāng)土松樹上表現(xiàn)為典型的病原主導(dǎo)性病害特點(diǎn)，病害流行程度與松樹的生長狀態(tài)關(guān)系不大，而是取決于松材線蟲能否傳播到這個(gè)區(qū)域感染松樹。 松樹一旦感染了松材線蟲，無論它本身生長狀況如何，結(jié)果大多會發(fā)病死亡，而且在一片松林中往往首先被傳病感染的是生長勢最好的松樹[12]。

日本和中國學(xué)者曾提出松材線蟲的適宜流行區(qū)域是年平均溫度14 ℃以上的地區(qū)，在年平均10 ～14 ℃的區(qū)域是松材線蟲病可以發(fā)生的地區(qū)[27－28]。根據(jù)此溫度分布，遼寧中部以南至黃河流域是松材線蟲病可以發(fā)生的區(qū)域，黃河以南的華中、華南、華東等廣大區(qū)域則大多是松材線蟲病比較適宜發(fā)生的區(qū)域[12]。 1982 年松材線蟲病在我國發(fā)生后直到2015 年，基本上都是在中國黃河以南最適宜病害發(fā)生的區(qū)域內(nèi)流行。 然而，2016 年遼寧大連出現(xiàn)數(shù)百公頃黑松嚴(yán)重感染松材線蟲病，2017 年遼寧撫順出現(xiàn)上千公頃油松林感染，其嚴(yán)重程度不像是在一個(gè)病害分布區(qū)北緣。 因此，依據(jù)中國松材線蟲病近年來發(fā)生的實(shí)際情況，對中國松材線蟲病發(fā)生區(qū)域又進(jìn)行了新一輪適生區(qū)預(yù)測分析，結(jié)果表明我國絕大多數(shù)省區(qū)均屬于松材線蟲病的高適生區(qū)或中適生區(qū)，僅有黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅絕大部分、青海、云南、西藏和新疆基本屬于低適生區(qū)或非適生區(qū)[12](圖1)。

圖1 松材線蟲病在中國的適生區(qū)Fig.1 Suitable area of pine wilt disease in China

2 松材線蟲病的病原

松樹萎蔫病在日本流行幾十年后，1969 年日本森林病理學(xué)家Kiyohara 和Tokushige 從被侵染死亡的松樹中分離到一種線蟲，并通過人工接種實(shí)驗(yàn)，于1971 年確定其就是引起松樹萎蔫病的病原。 該線蟲被鑒定命名為Bursaphelenchus lignicolus[29]，后被改為Bursaphelenchus xylophilus[30]。 該病原被稱為松材線蟲。 松材線蟲的分類地位[31]為:線蟲門Nematoda 側(cè)尾腺綱Secernentea 滑刃目Aphelenchida 滑刃亞目Aphelenchina 滑刃總科Aphelenchoidoidea 滑刃科Aphelenchoididae 傘滑刃屬Bursaphelenchus。

自1971 年以來，松材線蟲一直被認(rèn)為是松樹萎蔫病的病原，人工接種實(shí)驗(yàn)也證實(shí)松材線蟲能引起松樹萎蔫。 在接種的早期階段即樹脂分泌停止階段，松樹體內(nèi)線蟲量較少；當(dāng)松樹針葉變黃時(shí)，樹體內(nèi)線蟲的數(shù)量快速增長；松樹死后線蟲數(shù)量又逐漸減少。 將松材線蟲經(jīng)青霉素表面消毒后，接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)線蟲的致病性并未喪失[32－34]。 然而，在這些研究中，由于人工接種的線蟲都沒有完全殺死其體內(nèi)和體表的細(xì)菌，因此在一個(gè)時(shí)期曾有研究者提出松材線蟲攜帶的伴生細(xì)菌在病程中發(fā)揮了重要作用，認(rèn)為該病是由松材線蟲和伴生細(xì)菌共同復(fù)合侵染引起的，甚至提出松材線蟲病是松材線蟲與其體表攜帶的致病細(xì)菌共同侵入寄主，致病細(xì)菌分泌毒素導(dǎo)致寄主萎蔫和死亡[35－38]。 直到2012 年通過卵培養(yǎng)技術(shù)首次獲得了真正意義上的在松材線蟲體內(nèi)和體表都沒有細(xì)菌的無菌松材線蟲后，并用其在松樹上接種證明其依然可以致使松樹萎蔫，才完成了柯赫氏法則確定無菌線蟲具有致病性的過程[39]。 這一結(jié)果清晰地表明松材線蟲在沒有細(xì)菌的情況下可以致使松樹死亡，松材線蟲是松樹萎蔫病的病原。 當(dāng)然，不容忽視的是，在松材線蟲體內(nèi)和體表的伴生細(xì)菌對于線蟲生命活動(dòng)的影響或許是存在的，從而會間接地影響線蟲的致病力。

在松樹體內(nèi)寄生的線蟲種類很多，僅在中國就已經(jīng)報(bào)道有40 多種，其中傘滑刃屬Bursaphelenchus線蟲16 種，包括松材線蟲B.xylophilus、擬松材線蟲B.mucronatus、奇異傘滑刃線蟲B.aberrans、小角傘滑刃 線 蟲B.corneolus、 霍 夫 曼 傘 滑 刃 線 蟲B.hofmanni、赫列尼庫斯傘滑刃線蟲B.hellenicus、程氏傘滑刃線蟲B.chengi、樹皮象傘滑刃線蟲B.hylobianum、萊氏傘滑刃線蟲B.leoni、萊奴爾夫傘滑刃線蟲B.rainulfi、甬傘滑刃線蟲B.yongensis、泰國傘滑刃線蟲B.thailandae、擬小傘滑刃線蟲B.parapinaster、中華傘滑刃線蟲B.sinensis、吳氏傘滑刃線蟲B.wuae和東京傘滑刃線蟲B.tokyoensis。在松材線蟲病的病害診斷過程中，準(zhǔn)確鑒定松材線蟲是十分重要的。 同為傘滑刃屬的線蟲，有些種類在形態(tài)上與松材線蟲十分相近，在實(shí)際病害診斷中常會引起誤判，如擬松材線蟲與松材線蟲的區(qū)別主要表現(xiàn)在尾部尾尖突的長短等一些細(xì)微差異上[40]。

3 松材線蟲病的侵染循環(huán)

松材線蟲病的自然傳播是依賴媒介昆蟲在病株和健康植株之間的傳播。 能夠攜帶松材線蟲的昆蟲種類很多，但是真正可以傳播病害的媒介昆蟲主要是墨天牛屬M(fèi)onochamus的部分昆蟲[41]。 在東亞主要的媒介昆蟲是松墨天牛M.alternatus，其成蟲體表攜帶線蟲數(shù)量大多在數(shù)千頭以上，最多可以達(dá)十幾萬頭，具有補(bǔ)充營養(yǎng)特性，傳病效率和危害性極高。 在東亞的高緯度地區(qū)，主要傳病媒介昆蟲則是云杉花墨天牛M.saltuarius和云杉小墨天牛M.sutor[41－43]。 在歐洲主要傳病媒介昆蟲是加洛墨天牛M.galloprovincialis[44]。 北美洲已經(jīng)確定能攜帶松材線蟲的昆蟲有十多種，但主要的傳病媒介是卡羅來納墨天牛M.carolinensis[45]。

在不同的國家和地區(qū)，松材線蟲病侵染循環(huán)會有些變化，但總體的循環(huán)過程是相似的。 每年春季天牛從上一年病死的松樹中羽化飛出，天牛體上攜帶有病死樹中的松材線蟲。 在東亞主要的媒介昆蟲松墨天牛羽化后首先要尋找周圍健康松樹，并在其幼嫩的小枝上補(bǔ)充營養(yǎng)。 天牛取食樹皮時(shí)在松樹上造成傷口，體表攜帶的松材線蟲即轉(zhuǎn)移到健康松樹上并從傷口侵入寄主小枝。 松材線蟲在松樹體內(nèi)迅速生長繁殖，4 ～5 d 繁殖1 代，每頭雌成蟲可產(chǎn)卵80 粒左右。 松材線蟲的生命周期中有2 種發(fā)育型，第一種稱之為繁殖型，線蟲主要在松樹體內(nèi)生長，包括卵、1 ～4 齡幼蟲和成蟲，1 齡發(fā)生在卵內(nèi)，剛孵化出的幼蟲是2 齡階段，在合適的溫度下快速生長經(jīng)過3 齡和4 齡階段，一般4 ～5 d 即完成從卵到成蟲的生命周期。 繁殖型線蟲在健康松樹的維管組織及樹脂道內(nèi)不斷繁殖遷移，最快40 ～50 d 即可導(dǎo)致整株松樹死亡。 第二種是擴(kuò)散型，包括3 ～4 齡的擴(kuò)散型幼蟲，松材線蟲以3 齡擴(kuò)散型幼蟲在病死松樹內(nèi)越冬，到第二年早春發(fā)育為4 齡擴(kuò)散型幼蟲，向天牛蛹室轉(zhuǎn)移，并黏附在天牛成蟲體表，隨天牛成蟲羽化飛出，侵入健康松樹[46]。

松墨天牛成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)后，雌雄交配。 完成交配的雌成蟲到病死松樹或衰弱瀕死松樹上產(chǎn)卵，卵很快在樹皮下孵化，2 ～3 齡幼蟲在樹皮下取食，4 齡則進(jìn)入木質(zhì)部深處取食。 在1 a 僅有1 代的區(qū)域(中國發(fā)生區(qū)域里大部分省份)，天牛以4 齡老熟幼蟲在病死樹內(nèi)越冬，到第二年早春化蛹、羽化。 在緯度較低的南亞熱帶地區(qū)，如中國廣東省和福建省，由于冬季很短，適合天牛生長的季節(jié)時(shí)間很長，松墨天牛2 a 3 代或1 a 2 代，加上同一世代天牛羽化期不整齊，使得媒介昆蟲在一年中不僅世代交錯(cuò)，且一年中大多數(shù)時(shí)間均有天牛成蟲出現(xiàn)[12]。 在緯度較高的區(qū)域，如遼寧省，媒介昆蟲則以云杉花墨天牛為主[47－48]。

在中國36 °N 及其以南區(qū)域，松材線蟲病感染的松樹絕大多數(shù)表現(xiàn)為當(dāng)年感染當(dāng)年死亡，很少表現(xiàn)為當(dāng)年感染、當(dāng)年不表現(xiàn)癥狀，或當(dāng)年僅表現(xiàn)為個(gè)別枝梢死亡，整株松樹要到翌年春季死亡。 隨著緯度的增加，40 °N 及其以北地區(qū)，當(dāng)年感染的松樹，翌年春夏季才表現(xiàn)癥狀和死亡的比例明顯增加。

4 松材線蟲病的致病機(jī)理

松材線蟲的致病機(jī)理目前雖然還不完全清楚，但這方面研究一直倍受關(guān)注，且不斷有新的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展。 早期關(guān)于松材線蟲病的致病機(jī)理主要有3 個(gè)假說。 1)酶學(xué)說。 由松材線蟲食道腺產(chǎn)生的酶破壞松樹細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，影響寄主的水分傳輸。 2)毒素學(xué)說。 松材線蟲侵入寄主后，體表攜帶的細(xì)菌產(chǎn)生植物毒素或寄主植物受到干擾后自身產(chǎn)生有毒物質(zhì)。 3)空洞化學(xué)說。 線蟲侵染后，感病松樹受到入侵線蟲的刺激產(chǎn)生防御反應(yīng)，樹體內(nèi)萜烯類化合物含量增加，導(dǎo)致管胞內(nèi)形成空洞，阻礙松樹水分輸導(dǎo)從而引起松樹萎蔫。 近些年來關(guān)于松材線蟲致病機(jī)理的研究在許多方面，特別是在致病的分子機(jī)理方面，取得了非常多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大大豐富了對致病機(jī)理可能的全面闡釋。

Kikuchi 等從松材線蟲中克隆了內(nèi)切β－1，3 －葡聚糖酶基因，通過序列比較表明其是由細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移而獲得的，該結(jié)果對線蟲的菌食習(xí)性的意義理解有重要作用[49]。 Kikuchi 還從松材線蟲中克隆得到了Bx－pel－1和Bx－pel－2果膠酶基因，并表征其具有信號肽，由松材線蟲食道腺分泌至松樹體內(nèi)[50]。 Shibuya 等通過真核表達(dá)得到松材線蟲β－1 － 4 內(nèi) 切 葡 聚 糖 酶 基 因Bx － eng － 1、Bx－eng－2和Bx － eng － 3，發(fā)現(xiàn)松材線蟲分泌β－1 －4內(nèi)切葡聚糖酶，可以作用于松樹細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素復(fù)合物，導(dǎo)致松樹簿壁細(xì)胞的細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度減弱，促進(jìn)線蟲取食[51]。

2011 年松材線蟲全基因組公布[9]，加快了松材線蟲致病分子機(jī)理的研究進(jìn)程。 Espada 等研究表明松材線蟲有2 類保護(hù)自身免受來自宿主分泌的防御相關(guān)化合物侵害的方法[52－53]，一是將解毒相關(guān)酶分泌到宿主體內(nèi)，二是將解毒相關(guān)酶在消化系統(tǒng)中上調(diào)，消化攝入體內(nèi)的來自宿主的防御相關(guān)化合物。研究確定了2 種谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(GST)在松材線蟲食道腺中表達(dá)，并在侵染早期高表達(dá)，確定該酶在萜類化合物和過氧化物存在下對松材線蟲有保護(hù)作用，分泌到寄主植物體內(nèi)的GST 參與了松材線蟲對寄主植物防御相關(guān)化合物的解毒作用。Bx －pel －1被沉默后，松材線蟲的致病性顯著降低[54]，干擾松材線蟲L型半胱氨酸蛋白酶的Bx －CPL －1，Bx －CPL－2和Bx－CPL－3基因，會減少松材線蟲的取食和繁殖，并使其致病性下降[55]。

在松樹樹脂道中，萜烯類物質(zhì)是松樹抵抗松材線蟲的主要防御手段。 Zhang 等測定了用α－蒎烯和β－蒎烯處理的松材線蟲轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了許多與解毒相關(guān)的基因，如黃素單加氧酶(flavin monooxygenase，F(xiàn)MO)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)、短鏈脫氫酶(short chain dehydrogenase，SDR)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)、UDP －葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP － glucuronosyltransferase，UGT)和谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(glutathione S－transferases，GST)等均有明顯改變[56]。 Lin 等發(fā)現(xiàn)松材線蟲高毒力蟲株AMA3 暴露于α－蒎烯2 h 后，其自噬基因BxATG5、細(xì)胞色素P450 基因BxCYP33D3和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因BxGST1和BxGST3的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，低毒力蟲株YW4 僅表現(xiàn)較小的上調(diào)，表明高毒力蟲株比低毒力蟲株對松樹防御性物質(zhì)α－蒎烯和H2O2的抵抗力更大[57]。

效應(yīng)子作為一類在病原物侵染中起重要作用的分泌蛋白，已成為植物病理學(xué)致病機(jī)理相關(guān)研究的熱點(diǎn)[58－59]。 通過分析松材線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Espada等預(yù)測出一批松材線蟲候選效應(yīng)子，包括細(xì)胞色素P450 基因、溶菌酶蛋白基因、VAP 蛋白基因、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因等，還預(yù)測了松材線蟲植食階段的效應(yīng)子基因[52－53]。 Tanaka 預(yù)測出許多與線蟲發(fā)育相關(guān)基因及可能的效應(yīng)子基因[60]。 Hu 等通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并利用本氏煙Nicotiana benthamiana瞬時(shí)表達(dá)，篩選到松材線蟲效應(yīng)子BxSapB1，該效應(yīng)子作用于煙草細(xì)胞質(zhì)外體可觸發(fā)煙草PCD。 利用RNAi技術(shù)抑制BxSapB1表達(dá)，松材線蟲致病力明顯下降。BxSapB1在松材線蟲強(qiáng)毒蟲株中表達(dá)量較高，推測其對線蟲毒力可能起到重要作用[61]。 Huang等[62]和Zhao 等[63]篩選到能觸發(fā)煙草產(chǎn)生PCD 的松材線蟲效應(yīng)子BxSapB2和BxSapB3，這兩個(gè)效應(yīng)子表達(dá)被抑制后也會導(dǎo)致松材線蟲致病力下降。 Li等篩選到可抑制煙草PCD 的胞內(nèi)效應(yīng)子脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白Bx －FAR －1，該效應(yīng)子可影響松材線蟲在樹體內(nèi)的繁殖，并可通過干擾松樹茉莉酸途徑調(diào)節(jié)植物免疫，促進(jìn)線蟲侵染[64]。

除了抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)外，有的松材線蟲效應(yīng)子被證實(shí)會被植物免疫系統(tǒng)識別，導(dǎo)致與寄主植物的非親和互作。 Hu 等在松材線蟲中發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)新的病原相關(guān)分子模式(PAMP)BxCDP1，其在松材線蟲侵染早期上調(diào)表達(dá)，可以觸發(fā)松樹和煙草、擬南芥Arabidopsis thaliana等模式植物細(xì)胞壞死，觸發(fā)活性氧產(chǎn)生。 同時(shí)BxCDP1還具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)，BxCDP1被干擾后，松材線蟲的取食、繁殖和致病性均有所下降[65]。 Kirino 篩選到能夠觸發(fā)本氏煙壞死的2 個(gè)效應(yīng)子，松材線蟲類甜蛋白效應(yīng)子和半胱氨酸蛋白酶抑制劑效應(yīng)子，推測松材線蟲類甜蛋白在植物中或許可以激活植物的一些防御途徑[66]。 Meng 等研究表明松材線蟲類甜蛋白基因Bx－TLP－1的RNAi 干擾會影響松材線蟲的繁殖，并減弱松材線蟲侵染造成樹體空洞化的能力，降低線蟲致病性[67]。 這些研究表明松材線蟲效應(yīng)子在松材線蟲致病性和毒力中扮演了重要角色。

5 松材線蟲病的防治

根據(jù)松材線蟲病侵染循環(huán)規(guī)律，特別是對于北美洲以外區(qū)域該病害屬于檢疫性病害的特點(diǎn)，目前其防控方法主要是圍繞病害檢疫、疫情監(jiān)測、疫木除治、媒介昆蟲防治和樹干注射預(yù)防以及抗性選育等方面來展開的。

1)病害檢疫。 松材線蟲病的自然傳播，即通過媒介昆蟲傳播，其傳播距離是有限的，一般在3 ～5 km范圍內(nèi)；遠(yuǎn)距離傳播主要是通過人為活動(dòng)，將疫木及其制品從病害發(fā)生區(qū)傳帶到遠(yuǎn)距離的未發(fā)生區(qū)，媒介昆蟲再從中飛出，將松材線蟲傳播到其他健康松樹上。 在亞洲的中國、日本和韓國，人為傳播的主要載體是疫木、包裝箱、電纜盤和光纜盤。 病害檢疫包括對疫木及其產(chǎn)品開展產(chǎn)地檢疫和調(diào)運(yùn)檢疫2部分。 產(chǎn)地檢疫主要是針對疫區(qū)松木加工廠及集貿(mào)市場，檢查是否有帶病疫木。 調(diào)運(yùn)檢疫是嚴(yán)禁疫區(qū)松木及其帶疫產(chǎn)品傳出疫區(qū)或傳入非疫區(qū)。 檢疫主要是對受檢對象進(jìn)行外部觀察，當(dāng)疑似時(shí)則進(jìn)一步檢測其是否帶有松材線蟲。 檢測一般采用貝爾曼漏斗法，首先進(jìn)行線蟲分離，然后通過形態(tài)學(xué)顯微觀察或分子檢測來鑒定松材線蟲。 松材線蟲的分子檢測技術(shù)發(fā)展很快，核酸雜交技術(shù)、PCR－RFLP、RAPD、特異性引物PCR 技術(shù)、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)等分子檢測技術(shù)層出不窮[68－76]。 此外，松材線蟲分泌蛋白也被運(yùn)用到松材線蟲的檢測上，Osabutey 等人利用松材線蟲分泌蛋白PWN －SA571 合成單克隆抗體，利用單克隆抗體成功在松材線蟲代謝物和被松材線蟲侵染后的松樹提取物中檢測到了PWN－SA571 的存在[77]。 松材線蟲的分子檢測技術(shù)目前已經(jīng)在中國松材線蟲病疫區(qū)和預(yù)防區(qū)普及應(yīng)用[12]。

2)疫情監(jiān)測。 松材線蟲病在一個(gè)新的地區(qū)發(fā)生，早發(fā)現(xiàn)、早確診，可以比較容易控制病害的流行。反之，如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，等到大面積發(fā)生后才確診，就給病害控制帶來極大困難。 因此疫情監(jiān)測是病害防控的重要環(huán)節(jié)。 松材線蟲病的疫情監(jiān)測主要是以人工地面普查方式為主。 近年來航空監(jiān)測，尤其是無人機(jī)監(jiān)測也開始大量應(yīng)用于松材線蟲病疫情監(jiān)測中[78－79]，高分衛(wèi)星圖像也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了地面松樹健康狀況的清楚判讀，開始輔助于松材線蟲病的大范圍遠(yuǎn)距離監(jiān)測[80－81]。 無人機(jī)監(jiān)測和高分衛(wèi)星圖像輔助監(jiān)測，可以提高監(jiān)測的覆蓋面和效率，但最終還要結(jié)合地面調(diào)查來確診疫情，即當(dāng)對疫情進(jìn)行地面調(diào)查初步診斷后，還需進(jìn)行線蟲分離及種類鑒定才能最后確定疫情。

3)疫木除治隔離。 在中國松材線蟲病發(fā)生的大多數(shù)地區(qū)，媒介天牛1 a 1 代，松樹染病死亡后要經(jīng)過整個(gè)秋冬季，直到第二年春季病死樹中的天牛才會羽化飛出，傳播新一輪病害(媒介天牛2 a 3 代或1 a 2 代的地區(qū)除外)。 因此，利用秋冬季這一時(shí)期進(jìn)行疫木除治是病害防控的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，此時(shí)病原線蟲和媒介昆蟲都集中在疫木中，只要徹底殺滅干凈其中的天牛和線蟲，病害就可以得到有效的防治。 疫木除治基本上采用2 種方式，一是將疫木(包括直徑2 cm 以上枝條)清理下山，然后采用碎片、旋切、熏蒸、干燥等除疫處理后再加以利用(2018 年后國內(nèi)技術(shù)規(guī)程建議采用碎片和旋切2 種方式)。 當(dāng)疫木數(shù)量較少時(shí)，也可清理下山后就近直接采用控制性火燒處理。 這種處理方式難度在于疫木清理下山的干凈程度和疫木下山后在除疫處理過程的監(jiān)管程度。 另一種是在林間就地處理，即將疫木(包括直徑2 cm 以上枝條)就地堆積，用厚塑料膜或金屬網(wǎng)包裹，阻止天牛羽化飛出，或者在山上就近就地控制性燒毀或粉碎(2018 年后國內(nèi)技術(shù)規(guī)程建議在山上采取就地就近粉碎或燒毀方式，有些地區(qū)還在采用堆積覆蓋方式)。 這種就地就近處理方法不需要清理疫木下山，可減少疫木由疫區(qū)傳播到非疫區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)[82－86]，難度也同樣存在于疫木在山上堆放期間的管理。

4)媒介昆蟲防治。 天牛幼蟲是在松樹體內(nèi)生活，因此可在剛病死的松樹上釋放天敵昆蟲如腫腿蜂Scleroderma guani[87－88]和花絨寄甲Dastarcus helophoroides[89－91]寄生天牛幼蟲。 目前針對幼蟲期的防治難點(diǎn)在于，天敵在自然狀況下寄生率受環(huán)境影響波動(dòng)很大。 成蟲期防治是從天牛羽化飛出，到其至健康松樹上補(bǔ)充營養(yǎng)時(shí)起，再到天牛交配完成且至衰弱松樹上產(chǎn)卵期間，這一時(shí)期可采用地面樹冠化學(xué)噴霧或航空噴霧殺滅天牛成蟲[92]；或可使用引誘劑和誘捕器誘殺成蟲，或設(shè)置誘木誘集成蟲[93]。 成蟲期的防效主要受制于松褐天牛羽化期長(2 個(gè)月以上)和羽化期與雨季重疊等不利因素。

5)樹干注射預(yù)防。 針對重要的生態(tài)區(qū)和重要古松名木，國內(nèi)外研發(fā)多種樹干注射保護(hù)劑，用于預(yù)防和阻止松樹染病。 目前應(yīng)用效果較好的保護(hù)劑其有效成分主要是甲維鹽或阿維菌素，劑型有油劑和水乳劑等。 在使用時(shí)根據(jù)松樹樹干直徑大小確定不同注射劑量，一般施藥1 次可以保護(hù)松樹2 ～3 a 內(nèi)不被感染。 目前該預(yù)防保護(hù)技術(shù)已經(jīng)比較普遍地在一些重要風(fēng)景區(qū)和生態(tài)區(qū)應(yīng)用，作用效果明顯[12，78，94－97]。 關(guān)于注藥后的藥劑殘留時(shí)效與防病效果的關(guān)系、在樹木生長季的樹干注射技術(shù)等還需要深入細(xì)致的研究。

6)培育抗病樹種。 日本是較早開展松材線蟲病抗性育種研究的國家。 1973 年開始在鹿兒島建立抗病種子園，1978 年起經(jīng)過抗性候補(bǔ)木的選拔和9 次人工接種測定，最終選定108 個(gè)抗病無性系。1985 年起在部分縣營造抗病松樹采種園，采種育苗造林，并建立了次代抗病檢驗(yàn)林。 2010 年進(jìn)行3 次人工接種，從子代黑松中選擇出94 株高抗單株[98－100]。 中國于2001 年開始實(shí)施中日合作“安徽省馬尾松松材線蟲抗性育種”項(xiàng)目，從實(shí)生后代中進(jìn)行抗病性人工接種測定，于2006 年篩選出抗性候選單株200 多株，又進(jìn)一步篩選出高抗家系68 個(gè)。2011 年利用高抗家系的89 個(gè)無性系營建了抗病馬尾松種子園1.6 hm2[101－102]。

綜合分析以上各種防控技術(shù)手段，從目前各種防控技術(shù)發(fā)展水平和相應(yīng)的防治效果看，還應(yīng)清醒地認(rèn)識到，在近階段松材線蟲病的防控工作中，無論是在松材線蟲病疫情尚未發(fā)生的地區(qū)，還是在已經(jīng)發(fā)生的地區(qū)，都要把檢疫、疫情監(jiān)測和疫木除治作為松材線蟲病預(yù)防與控制的核心措施。 在疫情未發(fā)生的地區(qū)，首先要把檢疫和疫情監(jiān)測作為核心措施，一旦發(fā)現(xiàn)疫情才涉及到疫木除治的問題。 在病害已經(jīng)發(fā)生的地區(qū)，仍然要在堅(jiān)持做好檢疫和疫情監(jiān)測的基礎(chǔ)上，把疫木除治當(dāng)作最重要的核心防控措施。松材線蟲病的其他防治方法可作為防控的輔助方法，如媒介昆蟲的引誘劑防治、生物防治和化學(xué)防治等，可以有選擇性有針對性地加以應(yīng)用，引誘劑主要在未發(fā)生地區(qū)用于疫情監(jiān)測和降低媒介昆蟲蟲口密度[12]，樹干注射預(yù)防可在古樹名木的保護(hù)和重要生態(tài)區(qū)的松樹上應(yīng)用。

志謝:感謝南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院研究生李煜和張巖幫助收集和整理部分材料。