松材線蟲(chóng)基礎(chǔ)生物學(xué)研究進(jìn)展

孫薇，周立峰，陳靜，胡加付

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300；2. 臨海市林業(yè)技術(shù)推廣和場(chǎng)圃旅游服務(wù)總站，浙江 臨海 317000)

松材線蟲(chóng)Bursaphelenehus xylophilus是一種嚴(yán)重森林病原線蟲(chóng)，其引起的松材線蟲(chóng)病是世界范圍內(nèi)有歷史記載以來(lái)最為嚴(yán)重的森林病害。 由于松材線蟲(chóng)的適應(yīng)能力強(qiáng)、寄主分布范圍廣，該病在我國(guó)發(fā)生嚴(yán)重，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)災(zāi)難。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)松材線蟲(chóng)病開(kāi)展了大量研究，取得了顯著進(jìn)展，主要集中于松材線蟲(chóng)病的病原鑒定、傳媒昆蟲(chóng)、侵染循環(huán)、擴(kuò)散機(jī)制、致病機(jī)理、監(jiān)測(cè)預(yù)警和防控措施等方面。 在松材線蟲(chóng)本身的基礎(chǔ)生物學(xué)研究方面，近年來(lái)也取得了顯著進(jìn)展，但很多關(guān)鍵領(lǐng)域的研究仍較薄弱，包括松材線蟲(chóng)擴(kuò)散型幼蟲(chóng)和繁殖型幼蟲(chóng)相互轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制、松材線蟲(chóng)環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化、性別決定與分化的分子調(diào)控機(jī)理，以及松材線蟲(chóng)取食行為和與寄主松樹(shù)互作的生物學(xué)過(guò)程等等。 基礎(chǔ)生物學(xué)研究不足在很大程度上限制了病害系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論研究和發(fā)展，也對(duì)開(kāi)發(fā)特異性的防控技術(shù)形成了障礙。 筆者瞄準(zhǔn)松材線蟲(chóng)本身的基礎(chǔ)生物學(xué)研究，從個(gè)體發(fā)育、生理代謝、遺傳進(jìn)化和行為學(xué)等方面總結(jié)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，分析存在的問(wèn)題和不足，以期為深入開(kāi)展松材線蟲(chóng)病理論基礎(chǔ)研究提供參考。

1 發(fā)育生物學(xué)研究進(jìn)展

與模式線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans相比，松材線蟲(chóng)的發(fā)育生物學(xué)研究大多停留在形態(tài)觀察階段，對(duì)發(fā)育的分子調(diào)控過(guò)程缺乏深入系統(tǒng)的研究。 Hasegawa 等研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)的受精作用在雌性成蟲(chóng)輸卵管和四軸柱的連接通道中進(jìn)行，在25 ℃條件下，卵細(xì)胞和精細(xì)胞融合后約20 min就可以在外圍形成一層薄而透明的受精卵殼，受精卵呈長(zhǎng)橢圓形，在雌蟲(chóng)體內(nèi)不發(fā)育；受精卵產(chǎn)出后，首先會(huì)在側(cè)面中部出現(xiàn)雌性原核，幾分鐘后在受精卵的一個(gè)頂端顯現(xiàn)雄性原核，隨后雌性原核與雄性原核相互靠近，并在受精卵中部融合[1]。 進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)的第1 次卵裂發(fā)生在產(chǎn)卵后約60 min，形成大小不等的AB 細(xì)胞(大)和P1細(xì)胞(小)；約10 min 后，AB 細(xì)胞先分裂成ABp 和ABa 兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入三胞期，再過(guò)10 min 后P1分裂形成P2和EMS 兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入四胞期；從四胞期到八胞期，需要約10 min[2]。 此后，隨著細(xì)胞的持續(xù)分裂，受精卵內(nèi)出現(xiàn)了明顯的組織結(jié)構(gòu)，有一層較小的細(xì)胞(外胚層)包裹著一群較大的細(xì)胞(內(nèi)胚層)，整個(gè)受精卵進(jìn)入囊胚期(blastocyst stage)，從二胞期到囊胚期大約需要6 ～7 h。 之后，進(jìn)一步發(fā)育并進(jìn)入利馬豆期(lima bean stage)，1.5 h 后進(jìn)入蝌蚪期(tadpole stage)。 再過(guò)約1.5 h，內(nèi)陷到卵的一端，形成二折結(jié)構(gòu)，即二折期(loop stage)。 二折期胚胎已經(jīng)可以蠕動(dòng)，變細(xì)、伸長(zhǎng)，約3 h 后即可發(fā)育為四折的1 齡幼蟲(chóng)。 1 齡幼蟲(chóng)的唇區(qū)、口針、中食道球等器官尚未形成。 約1 h 后，1 齡幼蟲(chóng)蠕動(dòng)減緩，開(kāi)始第1 次脫皮，進(jìn)入2 齡幼蟲(chóng)階段。 2 齡幼蟲(chóng)唇區(qū)、口針、中食道球等器官清晰可見(jiàn)，不斷地在卵殼內(nèi)蠕動(dòng)，約4 h后，卵殼破裂，幼蟲(chóng)孵化[3]。 從受精卵產(chǎn)生到2齡幼蟲(chóng)孵化大約需要30 h。

松材線蟲(chóng)剛孵化出的2 齡幼蟲(chóng)體色較淡，取食后腸內(nèi)可見(jiàn)顆粒狀物質(zhì)，此后體色逐漸加深，唇區(qū)出現(xiàn)縊縮，中食道球變大，體長(zhǎng)為220 μm 左右，約1 d后脫皮成3 齡幼蟲(chóng)。 3 齡幼蟲(chóng)體長(zhǎng)為450 μm 左右，生殖細(xì)胞清晰可見(jiàn)，取食約1 d 后蛻皮為4 齡幼蟲(chóng)。4 齡幼蟲(chóng)唇區(qū)縊縮明顯，生殖腺快速增大，雌、雄生殖器官形成，此時(shí)體長(zhǎng)達(dá)到600 μm 左右，4 齡幼蟲(chóng)持續(xù)時(shí)間約1.5 d。 4 齡幼蟲(chóng)脫皮后為成蟲(chóng)，成蟲(chóng)體長(zhǎng)持續(xù)增加，雌、雄成蟲(chóng)很快交配產(chǎn)卵。 成蟲(chóng)生殖腺較大，各發(fā)育階段的生殖細(xì)胞清晰可見(jiàn)，雌成蟲(chóng)有陰門(mén)蓋，雄成蟲(chóng)交合刺明顯。 雌、雄成蟲(chóng)交配時(shí)長(zhǎng)約為23 min[4－5]，交配后雌蟲(chóng)隨即開(kāi)始產(chǎn)卵，產(chǎn)卵期長(zhǎng)達(dá)1 周，平均產(chǎn)卵約79 粒[6]。 在25 ℃條件下，松材線蟲(chóng)完成1 代需要約5 d[7]，30 ℃條件下松材線蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育最快，但高于33 ℃發(fā)育速度將被抑制，其發(fā)育的最低溫度為9.5 ℃[8－10]，但具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力，并且經(jīng)過(guò)低溫馴化后，耐寒能力隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高[11]。

松材線蟲(chóng)發(fā)育分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，根本原因在于基因敲除和基因編輯技術(shù)尚未在松材線蟲(chóng)體內(nèi)獲得成功。 松材線蟲(chóng)的體寬較窄，只有50 μm左右，現(xiàn)有的顯微注射技術(shù)會(huì)對(duì)松材線蟲(chóng)的性腺產(chǎn)生較大傷害，甚至直接將身體一分為二，大部分個(gè)體都因傷害過(guò)重而死亡。 另外，松材線蟲(chóng)為雌雄異體，極少數(shù)能夠存活的個(gè)體要完成傷口愈合、順利交配，并獲得穩(wěn)定遺傳性狀的下一代，成功率極低。 因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲(chóng)發(fā)育的分子生物學(xué)研究大多采用浸泡RNAi 技術(shù)，由于該技術(shù)干擾效率不高，往往存在研究結(jié)果不穩(wěn)定和重復(fù)性較差等問(wèn)題。 周立峰 等研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)mab－3基因具有雄性特異性，在松材線蟲(chóng)的精子發(fā)生和雄性個(gè)體發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用，并能夠調(diào)控雄性成蟲(chóng)的交配行為；mab－3基因被干擾之后，松材線蟲(chóng)雄性成蟲(chóng)的體長(zhǎng)和體內(nèi)的精子大小都明顯變小，雄性成蟲(chóng)不能進(jìn)行正常的交配，無(wú)法準(zhǔn)確定位雌蟲(chóng)的陰戶(hù)部位，交配出錯(cuò)率明顯上升[12]。 已有研究結(jié)果表明，很多基因被干擾之后，松材線蟲(chóng)的胚胎孵化率都會(huì)顯著降 低， 如Bxy－octr－1、madd－4、Bxy－egl－30、Bxy－fuca和Bxy4022等[13－17]，這可能與胚胎發(fā)育的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，同時(shí)表明松材線蟲(chóng)的胚胎發(fā)育可能受到多個(gè)基因的調(diào)控。 有趣的是，雖然松材線蟲(chóng)長(zhǎng)期生活在樹(shù)體之內(nèi)，但光照能夠顯著地抑制其個(gè)體發(fā)育，其中藍(lán)光的抑制作用最強(qiáng)，并顯著抑制其種群數(shù)量增長(zhǎng)[18－19]。 早在20 世紀(jì)80 年代，Kaneko 就已經(jīng)證實(shí)光照能夠抑制松材線蟲(chóng)病的發(fā)病進(jìn)程[20]。

擴(kuò)散型Dauer 幼蟲(chóng)的形成是松材線蟲(chóng)病病害流行的基礎(chǔ)，但國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲(chóng)Dauer 幼蟲(chóng)的形成機(jī)理尚沒(méi)有取得突破性進(jìn)展。 Kikuchi 等研究發(fā)現(xiàn)了20 多個(gè)與松材線蟲(chóng)擴(kuò)散型幼蟲(chóng)形成相關(guān)的基因，包括insulin/IGF－1 路徑中的daf － 2、daf － 18、daf－16、age－1、pdk －1、akt －1、akt －2和sgk －1，TGF－β路徑中的daf －1、daf －3、daf －4、daf －7、daf－8、daf－14、scd －1、scd －2、bra －1和king －8，鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶路徑中的daf －11、tax －2和tax －4，以及類(lèi)固醇激素路徑中的daf －9和daf －12[21－22]。趙利藺等研究發(fā)現(xiàn)，松墨天牛在羽化過(guò)程中釋放大量C15 －C18 脂肪酸乙酯，啟動(dòng)松材線蟲(chóng)Insulin 和DA/DAF－12 信號(hào)通路，改變發(fā)育途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)擴(kuò)散型3 齡幼蟲(chóng)(LⅢ) 形成擴(kuò)散型4 齡幼蟲(chóng)(LIV)[23]，但對(duì)轉(zhuǎn)型發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程沒(méi)有開(kāi)展深入研究。 對(duì)松材線蟲(chóng)部分daf基因的生物學(xué)功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，基因daf－9和daf －12對(duì)松材線蟲(chóng)擴(kuò)散周期具有一定的調(diào)控作用[24]；采用RNAi 技術(shù)分析松材線蟲(chóng)基因daf－6的生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)，該基因能夠在一定程度上抑制松材線蟲(chóng)擴(kuò)散型幼蟲(chóng)的形成[25]；根據(jù)daf－8和akt－1基因的研究結(jié)果，推測(cè)松材線蟲(chóng)在休眠幼蟲(chóng)Dauer 形成之前的繁殖型2 齡幼蟲(chóng)(J2)期啟動(dòng)了insulin/IGF － 1 信號(hào)路徑和TGF－β信號(hào)路徑，但這2 個(gè)基因都不能夠單獨(dú)調(diào)控松材線蟲(chóng)Dauer 幼蟲(chóng)的形成[26－27]。

2 生理代謝研究進(jìn)展

松材線蟲(chóng)的致病機(jī)理是當(dāng)前松材線蟲(chóng)病研究的前沿和熱點(diǎn)，盡管難以獲得直接的證據(jù)，但不少學(xué)者認(rèn)為松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶和毒素是引起松樹(shù)死亡的主要原因。 因此，現(xiàn)有生理代謝研究大多數(shù)是基于松材線蟲(chóng)的致病性而開(kāi)展的纖維素酶和毒素基因的生物學(xué)功能驗(yàn)證。 研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)分泌的纖維素酶能夠破壞松樹(shù)薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致松脂從樹(shù)脂道中滲漏并擴(kuò)散到相鄰的管胞中，使松樹(shù)水分輸導(dǎo)受阻，引起松樹(shù)萎蔫[28－29]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)基因組中有3 個(gè)類(lèi)毒液過(guò)敏原家族蛋白，能誘導(dǎo)寄主松樹(shù)的防御反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)，如α－蒎烯大量積累和細(xì)胞死亡[30－31]，干擾松材線蟲(chóng)類(lèi)毒液過(guò)敏原蛋白后，松材線蟲(chóng)在寄主體內(nèi)的遷移率明顯降低，致病力降低[32]。

作為病原生物，松材線蟲(chóng)侵入寄主之后必然引起松樹(shù)一系列的防御反應(yīng)，松樹(shù)次生代謝產(chǎn)物的大量產(chǎn)生是其防御反應(yīng)的重要手段，如蒎烯等次級(jí)代謝產(chǎn)物；松材線蟲(chóng)對(duì)松樹(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物的分解代謝過(guò)程，是其成功入侵和定殖的必要條件[33－34]。 研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)能夠給寄主松樹(shù)次生代謝產(chǎn)物加上額外的功能團(tuán)，使其更適合作為下游反應(yīng)的底物，隨后進(jìn)行解毒代謝，最后排出體外。 例如，松材線蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450 家族的基因拷貝數(shù)明顯大于秀麗隱桿線蟲(chóng)，其功能是可以改變次生代謝產(chǎn)物的功能基團(tuán)，使其更適合作為下游反應(yīng)的底物[22，35]；P450 家族的CYP33C9、CYP33C4和CYP33D3基因與松材線蟲(chóng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝相關(guān)，能提高松材線蟲(chóng)在寄主體內(nèi)的適應(yīng)性，從而增強(qiáng)松材線蟲(chóng)繁殖率和致病性，是松材線蟲(chóng)入侵過(guò)程中的重要關(guān)鍵因子[36－38]。 與這些研究結(jié)果類(lèi)似，王璇認(rèn)為，松材線蟲(chóng)的激發(fā)基因能夠誘導(dǎo)松樹(shù)的防御反應(yīng)，引發(fā)松樹(shù)體內(nèi)蒎烯類(lèi)有毒次生代謝物質(zhì)的大量積累，松材線蟲(chóng)解毒基因隨之大量表達(dá)，轉(zhuǎn)化利用并消耗松樹(shù)的次生代謝產(chǎn)物[39]。 此外，林世鋒 等認(rèn)為，松材線蟲(chóng)食道腺分泌的Expansin 是一種細(xì)胞壁松弛蛋白，具有軟化寄主松樹(shù)細(xì)胞壁作用[40]。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)食道腺細(xì)胞可以特異性表達(dá)一類(lèi)依賴(lài)于Ca2＋的果膠酸裂解酶，通過(guò)口針?lè)置诘郊闹魉蓸?shù)組織內(nèi)部，促進(jìn)果膠類(lèi)物質(zhì)分解，以利于其取食[41]。

在松材線蟲(chóng)的生理代謝方面，對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)的合成與分解等傳統(tǒng)生理代謝研究尚未見(jiàn)報(bào)道，而脂肪粒的大量形成是松材線蟲(chóng)Dauer 幼蟲(chóng)最重要的特征之一，深入研究其形成的生物學(xué)過(guò)程和分子調(diào)控機(jī)制具有十分重要的科學(xué)意義，也是亟待研究的科學(xué)問(wèn)題之一。

3 遺傳進(jìn)化研究進(jìn)展

松材線蟲(chóng)源自北美洲[42－43]，在分類(lèi)學(xué)上屬于寄生滑刃科Parasitaphelenchidae 傘滑刃亞科Bursaphelenchinae 傘滑刃屬Bursaphelenchus[44]。 與松材線蟲(chóng)親緣關(guān)系最近的物種是擬松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus mucronatus，兩者在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性等方面高度相似，擁有相同的食物資源，共享同樣的傳媒昆蟲(chóng)，并在空間生態(tài)位上高度重疊，僅在致病力和雌性成蟲(chóng)的尾尖形態(tài)上有所差異[45－46]。 因此，松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)是否是同一個(gè)物種以及兩者之間的進(jìn)化關(guān)系一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)。 Kanzaki 等通過(guò)對(duì)rDNA 的18S、5.8S、ITS1、ITS2 序列及COI 基因的部分序列系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為，擬松材線蟲(chóng)起源于歐亞大陸的東部，而松材線蟲(chóng)則是由歐亞大陸傳入北美的擬松材線蟲(chóng)分化而來(lái)[43]。 Pereira 等利用COI，ITS2，28S rDNA 等分子生物學(xué)手段，綜合全球范圍內(nèi)已報(bào)道的擬松材線蟲(chóng)、松材線蟲(chóng)的相關(guān)分子生物學(xué)信息，進(jìn)一步證實(shí)了Kanzaki 等的假說(shuō)，即松材線蟲(chóng)起源于北美，而擬松材線蟲(chóng)起源于歐亞大陸[44]。 周立峰 等人應(yīng)用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記對(duì)東亞地區(qū)不同地理來(lái)源的松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，擬松材線蟲(chóng)形成更多的獨(dú)立區(qū)域，而松材線蟲(chóng)緊緊聚在一起，不同地理來(lái)源的擬松材線蟲(chóng)與松材線蟲(chóng)在遺傳上沒(méi)有交叉[45]。 因此，盡管松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的親緣關(guān)系很近，但它們?nèi)匀皇? 個(gè)物種。采用第三代基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲(chóng)無(wú)論是基因組還是基因體量均比松材線蟲(chóng)略大；進(jìn)化分析結(jié)果表明，松材線蟲(chóng)進(jìn)化速率比擬松材線蟲(chóng)略快，但與

Caenorhabditis briggsae，C.elegans，Ditylenchus destructor，D.melanogaster和Strongyloides ratti等其他物種相比，進(jìn)化速率居中，而分化時(shí)間卻是最晚的，這在一定程度上支持了松材線蟲(chóng)可能是擬松材線蟲(chóng)一個(gè)分支的推測(cè)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。

松材線蟲(chóng)生活在松樹(shù)體內(nèi)，大部分時(shí)間以微生物為食。 同源性進(jìn)化分析結(jié)果表明，松材線蟲(chóng)基因組中的一些與寄生相關(guān)的基因可能是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移從微生物基因組中獲得的[46－48]。 例如:松材線蟲(chóng)基因組中的一些獨(dú)特的細(xì)胞壁降解酶——糖苷水解酶45 家族纖維素酶，是其他線蟲(chóng)所不具有的，但和真菌中的相關(guān)基因同源性最高[22]。 另外，松材線蟲(chóng)的β－1，3 －葡聚糖苷酶和β－1，4 －葡聚糖苷酶的基因與細(xì)菌纖維素酶基因同源性較高，這可能是在演化過(guò)程中從細(xì)菌基因組整合到松材線蟲(chóng)基因組的基因水平轉(zhuǎn)移結(jié)果[49]。

松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)的親緣關(guān)系極為接近，能否進(jìn)行種間雜交，以及雜交后代的繁殖力和致病力等問(wèn)題很早就引起人們的重視。 Mamiya 等報(bào)道松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)的雜交F1 代不可育[50]；Bolla 等報(bào)道部分松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的雜交F1代可育[51]；Braasch 通過(guò)不同地理來(lái)源的松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，德國(guó)擬松材線蟲(chóng)和日本松材線蟲(chóng)與其他國(guó)家的松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的種間雜交能夠成功，且后代線蟲(chóng)與日本松材線蟲(chóng)株系能夠進(jìn)一步雜交并產(chǎn)生有致病力的后代[52]；劉偉 等用中國(guó)不同株系的擬松材線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)與其他國(guó)家的擬松材線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)進(jìn)行種間雜交發(fā)現(xiàn)，能夠雜交成功，但后代數(shù)量偏少且大多不育[53]；季宏鐵研究發(fā)現(xiàn)，大部分雜交組合的后代經(jīng)過(guò)1 代或多代培養(yǎng)后死亡，無(wú)法形成可延續(xù)的種群，只有極少數(shù)組合產(chǎn)生可延續(xù)的雜交后代[54]；賁愛(ài)玲 等通過(guò)正交和反交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)的雄蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)的雌蟲(chóng)(正交)的雜交率，最高可達(dá)93.8%，顯著高于反交的雜交率，但雜交后代線蟲(chóng)普遍存在畸形和死亡率高的現(xiàn)象[55]；應(yīng)晨希 等通過(guò)4 個(gè)不同地理種群松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然能夠完成雜交，但成功率偏低，松材線蟲(chóng)的雄蟲(chóng)比擬松材線蟲(chóng)的表現(xiàn)出更強(qiáng)的雜交趨向，具有明顯的不對(duì)稱(chēng)種間雜交優(yōu)勢(shì)[56]。 擬松材線蟲(chóng)與松材線蟲(chóng)能夠完成種間雜交，但雜交后代的繁殖能力尚未得到一致性結(jié)論，這可能是由所用線蟲(chóng)株系不同造成的。 另外，經(jīng)過(guò)數(shù)代人工飼養(yǎng)之后，松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的雜交能力可能也會(huì)有一定的下降。 在自然條件下，松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)處于完全的混生狀態(tài)，這種條件下的雜交率尚有待進(jìn)一步研究。 與擬松材線蟲(chóng)相比，松材線蟲(chóng)具有更強(qiáng)的繁殖能力，其種群數(shù)量極大，即使只有極低的雜交效率，也會(huì)有效放大其種間不對(duì)稱(chēng)交配效應(yīng)，增強(qiáng)其種間競(jìng)爭(zhēng)能力，并最終占據(jù)生態(tài)位，這一點(diǎn)已經(jīng)被Cheng 等[57]和季錦衣[58]所證實(shí)。 無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是在野外，松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)混合培養(yǎng)時(shí)都會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)替代現(xiàn)象，即混合種群中松材線蟲(chóng)的種群數(shù)量會(huì)逐漸占優(yōu)并最終替代擬松材線蟲(chóng)[57－58]。

按照科學(xué)界對(duì)“種”的定義，如果松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)是2 個(gè)不同的種，應(yīng)該存在生殖隔離，即相互之間不能交配，或者交配產(chǎn)生的后代不可育。 目前，學(xué)術(shù)界根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果公認(rèn)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)是2 個(gè)不同的種，但已有的研究結(jié)果表明，他們之間確實(shí)能夠交配，且雜交后代在幾代以?xún)?nèi)能夠成功再育。 雖然雜交后代能否在自然條件下永久延續(xù)尚有待進(jìn)一步確認(rèn)，但已經(jīng)對(duì)“種”的定義提出了挑戰(zhàn)。 在分子生物學(xué)鑒定技術(shù)出現(xiàn)之前，學(xué)術(shù)界對(duì)于不同物種的劃分是基于個(gè)體形態(tài)的差異，且大多數(shù)是定性描述的結(jié)果，沒(méi)有定量的衡量指標(biāo)，而生物的個(gè)體形態(tài)存在多樣性，這為物種分類(lèi)帶來(lái)了困擾，科學(xué)界對(duì)于“種”的定義是對(duì)傳統(tǒng)物種形態(tài)分類(lèi)結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)，并以生殖隔離作為基本衡量標(biāo)準(zhǔn)。 按照傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)和科學(xué)界對(duì)“種”的定義，松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)完全可以劃歸為同一個(gè)物種。 但現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)是根據(jù)遺傳物質(zhì)核酸序列的相似度確認(rèn)生物的種類(lèi)，當(dāng)特定片段核酸序列的相似度大于一定的數(shù)值時(shí)便認(rèn)為是同一個(gè)物種，并沒(méi)有將生殖隔離作為新物種確認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。 因此，隨著分子技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用，尤其是更多沒(méi)有嚴(yán)格生殖隔離但核酸序列又存在一定差異現(xiàn)象的出現(xiàn)，也許科學(xué)界需要對(duì)“種”的內(nèi)涵重新定義。

4 行為學(xué)研究進(jìn)展

在自然條件下，松材線蟲(chóng)長(zhǎng)期生活在樹(shù)體內(nèi)，且個(gè)體微小，難以跟蹤，故國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲(chóng)的行為學(xué)只有一些零星的報(bào)道，缺乏深入系統(tǒng)的研究。 趙利藺 等研究發(fā)現(xiàn)，剛羽化的媒介昆蟲(chóng)表皮硬化前產(chǎn)生長(zhǎng)鏈蛔甙類(lèi)物質(zhì)(Asc －C9)引誘松材線蟲(chóng)進(jìn)入氣管，從死亡松樹(shù)轉(zhuǎn)移到媒介昆蟲(chóng)[59]。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，媒介天牛在取食補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和產(chǎn)卵過(guò)程中代謝和呼吸速率增加，導(dǎo)致其氣管內(nèi)CO2含量升高，高濃度的CO2能夠驅(qū)動(dòng)松材線蟲(chóng)從媒介天牛氣門(mén)溢出，并通過(guò)取食或產(chǎn)卵造成的傷口進(jìn)入新的寄主松樹(shù)[60]。 實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明，松材線蟲(chóng)不同發(fā)育階段的繁殖型幼蟲(chóng)表現(xiàn)出不同的趨光性，J2 幼蟲(chóng)對(duì)短波長(zhǎng)的藍(lán)光、紫光以及復(fù)合白色光源具有一定的趨向性，而J3、J4 和成蟲(chóng)對(duì)紫光卻表現(xiàn)出明顯的趨避性。 與繁殖型J4 幼蟲(chóng)不同，擴(kuò)散型DLIV幼蟲(chóng)對(duì)所有波長(zhǎng)的可見(jiàn)光均表現(xiàn)出一定的趨避性，這在一定程度上促進(jìn)了DLIV幼蟲(chóng)在寄主轉(zhuǎn)移過(guò)程中向松樹(shù)體內(nèi)移動(dòng)[61]。

在繁殖行為學(xué)方面，Liu 等研究了松材線蟲(chóng)的交配行為，將整個(gè)交配過(guò)程分為搜尋、接觸、交尾和逗留4 個(gè)階段，并進(jìn)一步分解為逡巡、靠近、相遇、觸摸、卷曲、定位、固定、射精、解尾、靜止和徘徊等11個(gè)動(dòng)作，整個(gè)過(guò)程持續(xù)80 min 左右，平均交尾時(shí)長(zhǎng)為23 min。 與高等動(dòng)物相似，松材線蟲(chóng)在交配過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的性吸引，在性別比例不平衡時(shí)，雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)都存在激烈的性?xún)?nèi)競(jìng)爭(zhēng)[4－5]。 理永霞 等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雌雄比為3.4∶1 時(shí)松材線蟲(chóng)的繁殖成功效率最高，種群增長(zhǎng)速度最快[62]，其內(nèi)在的生物學(xué)機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。 盡管松材線蟲(chóng)與寄主松樹(shù)之間的互作關(guān)系是松材線蟲(chóng)病病害系統(tǒng)的核心要素，但尚未見(jiàn)有松材線蟲(chóng)對(duì)松樹(shù)取食行為的報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)初步觀察結(jié)果表明，松材線蟲(chóng)在取食松質(zhì)食物時(shí)口針外露，并用口唇反復(fù)多次接觸，這可能是其利用味覺(jué)進(jìn)行食物選擇的過(guò)程；與取食松質(zhì)食物不同，松材線蟲(chóng)在取食灰葡萄孢Botrytis cinera的過(guò)程中，先將身體移動(dòng)到合適的位置，通過(guò)頭部伸縮將口唇對(duì)準(zhǔn)菌絲的橫切面，再用口針將菌絲送進(jìn)口腔，表現(xiàn)出明顯的移動(dòng)、定位、伸縮、取食和吞咽動(dòng)作(待發(fā)表)。

綜上所述，國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲(chóng)的基礎(chǔ)生物學(xué)開(kāi)展了較多的研究，并取得了一定的進(jìn)展，但現(xiàn)有研究大多停留在現(xiàn)象觀察水平，尚沒(méi)有在分子水平上揭示其內(nèi)在機(jī)制，存在許多亟待解決的科學(xué)問(wèn)題，這在很大程度上阻礙了新型防控技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)。 因此，突破松材線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)瓶頸，建立成熟的松材線蟲(chóng)病分子研究技術(shù)體系，深入開(kāi)展松材線蟲(chóng)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究，并針對(duì)病害流行的關(guān)鍵薄弱環(huán)節(jié)開(kāi)發(fā)特異性的防控技術(shù)，應(yīng)該是未來(lái)松材線蟲(chóng)病研究的核心和重點(diǎn)。