右美托咪定對腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜屏障的影響及其機(jī)制

王 玥,王建剛

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:2676083197@qq.com)

膿毒癥是由細(xì)菌等病原微生物侵入機(jī)體導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，而腸道是膿毒癥全身反應(yīng)的啟動(dòng)器官[1]。據(jù)報(bào)道，膿毒癥可激活Wnt/β-catenin信號通路并損傷腸黏膜機(jī)械屏障，大量炎癥因子釋放引起瀑布效應(yīng)促進(jìn)膿毒癥惡化[2,3]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有抗炎、保護(hù)腸道通透性和腸道屏障等功能[4]，但具體機(jī)制尚不明確。本研究擬探究DEX對腸源性膿毒癥產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制，對于臨床治療膿毒癥提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8～9周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級，生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2019-0005。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，不限飲水。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、膿毒癥組和DEX組，每組20只。膿毒癥組和DEX組均以盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥模型，DEX組腹腔注射DEX，對照組僅暴露盲腸，不做結(jié)扎及穿孔。

1.2 主要試劑

右美托咪定(200 μg/2 ml)，批號：210804BC，國藥準(zhǔn)字：H20090248，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Wnt3a蛋白單克隆抗體、β-連環(huán)蛋白單克隆抗體、細(xì)胞周期蛋白D1單克隆抗體、閉合蛋白單克隆抗體以及閉鎖蛋白單克隆抗體均購自英國Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 膿毒癥大鼠模型的建立

結(jié)扎盲腸并穿孔建立SD大鼠膿毒癥模型[1]。具體操作方法：腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠：切開腹壁，暴露盲腸，于回盲瓣的遠(yuǎn)端(距盲腸尖端1 cm處)將盲腸用4-0絲線緊密結(jié)扎并用針穿刺造成腸道損傷，從損傷口輕輕擠壓擠出穿孔部位少許糞便，盡量保證擠出糞便量一致(直徑約為1 mm的小液滴)，完成后閉合手術(shù)切口。對照組僅暴露盲腸遠(yuǎn)端，不做結(jié)扎、不穿孔。給予無菌生理鹽水溶液(24 ml/kg)皮下注射；模型建立成功后，DEX組即刻腹腔注射40 μg/kg DEX(8 ml/kg，5 μg/ml)，對照組以及膿毒癥組腹腔注射等體積的生理鹽水后使大鼠自然蘇醒。實(shí)驗(yàn)期間不使用任何抗生素。

1.4 腸組織病理學(xué)觀察

分別于膿毒癥模型建立成功24 h后使用戊巴比妥鈉腹腔注射處死大鼠(每組5只)，手術(shù)切取空腸組織，甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織切片。

1.5 ELISA試劑盒檢測大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度

末次給藥后24 h，尾靜脈采血1.5 ml，3 000 r/min，4 ℃離心20 min后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，包被后封閉、加樣、孵育酶標(biāo)抗體(抗體稀釋比例均為1 ∶100)，加底物工作液、終止液，測量血清中炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)的濃度。

1.6 Western blot檢測大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白的表達(dá)量

將空腸組織蛋白(RIPA試劑提取)與上樣緩沖液(SDS)混合煮沸；電泳分離蛋白樣品；凝膠轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜；膜在室溫下加脫脂奶粉封閉；加入一抗：兔抗Wnt3a單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體、兔抗Cyclin D1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體，兔抗ZO-1單克隆抗體、兔抗Occludin單克隆抗體(稀釋比例均為1 ∶4 000)，冰箱冷藏孵育過夜；加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，灰度值分析后得到各蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 免疫組化染色觀察大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)

石蠟切片脫蠟至水；抗原修復(fù)；過氧化氫處理；牛血清白蛋白(BSA)封閉；加入一抗：兔抗Wnt3a單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體、兔抗Cyclin D1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體，兔抗ZO-1單克隆抗體、兔抗Occludin單克隆抗體(稀釋比例均為1 ∶200)；加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；復(fù)染細(xì)胞核；脫水封片；置于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料符合正態(tài)分布，均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS24.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察腸黏膜病理學(xué)表現(xiàn)

HE染色檢查結(jié)果顯示，對照組大鼠腸黏膜完整，絨毛結(jié)構(gòu)排列規(guī)律且緊密，不存在腸黏膜損傷；膿毒癥組腸組織結(jié)構(gòu)混亂，存在嚴(yán)重的黏膜絨毛水腫和上皮細(xì)胞脫落以及中性粒細(xì)胞浸潤；與膿毒癥組比較，DEX組可見腸道病理損傷明顯改善，組織水腫得到顯著改善，絨毛排列較為整齊，腸道黏膜屏障較好，中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少(見圖1)。

圖1 各組大鼠腸道黏膜病理學(xué)變化 (×200)Figure 1 HE staining of intestinal mucosa in each group (×200)

2.2 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度結(jié)果

與對照組相比，膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增高(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.01，見表1)。

表1 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度 (pg/ml，n=20)

2.3 Western blot檢測各組大鼠腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)結(jié)果

與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a的蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組大鼠腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a的蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01，見圖2)。

與對照組比較，**P<0.01;與膿毒癥組比較，##P<0.01圖2 大鼠腸道組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)Figure 2 Expression of Wnt3a, β-catenin, Cyclin D1, ZO-1 and Occludin in rat intestinal tissue

2.4 免疫組化染色各組大鼠腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組化法觀察顯示，Wnt3a蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(呈深褐色)，β-catenin蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架中(呈黃褐色)，Cyclin D1蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中(呈黃褐色,見圖3)。與對照組比較，膿毒癥組腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01，見圖4)。

圖3 大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)結(jié)果 (×400)Figure 3 Expression of Wnt3a, β-catenin and Cyclin D1 in rat intestinal tissue (×400)

與對照組比較，**P<0.01；與膿毒癥組比較，##P<0.01圖4 免疫組化染色檢測各組大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達(dá)Figure 4 Immunohistochemical staining of Wnt3a, β-catenin and Cyclin D1 protein expression in the intestinal tissues of rats in each group

3 討論

膿毒癥是國內(nèi)外重癥醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題。世界衛(wèi)生組織2017報(bào)告中指出年全世界有4 800萬例膿毒癥病例和1 100萬例膿毒癥相關(guān)的死亡，占全球死亡總數(shù)的近20%。全世界大約85%的膿毒癥病例發(fā)生在低收入和中等收入國家。腸道作為人體內(nèi)最大細(xì)菌貯存的場所，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。機(jī)體健康的情況下，腸道內(nèi)的細(xì)菌無損害作用；腸黏膜被損害時(shí)，細(xì)菌遷移進(jìn)入腸系膜及其淋巴組織甚至血液中，引發(fā)全身性的膿毒癥[5]。因此，腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要，保護(hù)其完整性可緩解腸源性膿毒癥的癥狀，改善預(yù)后[6]。

膿毒癥發(fā)生時(shí)內(nèi)毒素入血，刺激血液中的炎性細(xì)胞分泌炎癥因子，這些因子一方面可對機(jī)體的組織細(xì)胞產(chǎn)生炎性損傷；另一方面，可進(jìn)一步刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的炎癥因子，最終導(dǎo)致“瀑布效應(yīng)”，這種惡性循環(huán)進(jìn)一步導(dǎo)致膿毒癥惡化[7]。而Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控炎癥因子釋放，并有研究證實(shí)抑制Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白的表達(dá)可以降低TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，緩解膿毒癥所導(dǎo)致的機(jī)體器官損傷[2，8]。大量文獻(xiàn)及臨床研究表明，DEX的抗炎等作用對膿毒癥的治療具有積極意義[9]。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果證明膿毒癥組大鼠腸道組織結(jié)構(gòu)混亂，存在嚴(yán)重的黏膜絨毛水腫，上皮細(xì)胞脫落，中性粒細(xì)胞浸潤。與膿毒癥組比較，DEX組可見腸道組織水腫減輕，絨毛排列較為整齊，腸道病理損傷明顯緩解。同時(shí)本研究ELISA結(jié)果與文獻(xiàn)中[10]DEX對膿毒癥釋放炎癥因子的調(diào)控作用結(jié)果一致，即與膿毒癥組相比，DEX組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，DEX可有效減少促炎因子的釋放，從而改善膿毒癥預(yù)后。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對Wnt/β-catenin信號通路與緊密連接蛋白進(jìn)行了檢測，探討在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中DEX是否會(huì)通過影響Wnt/β-catenin信號通路與緊密連接蛋白緩解膿毒癥癥狀。Western blot檢測結(jié)果和免疫組化染色結(jié)果共同提示：與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著升高；與膿毒癥組相比，腹腔注射DEX的大鼠腸黏膜中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平明顯降低。表明DEX可能參與并抑制了Wnt/β-catenin信號通路，從而減少了炎性因子的表達(dá)，發(fā)揮對腸黏膜的保護(hù)作用。

在腸源性膿毒癥導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞間的連接遭到破壞，腸黏膜屏障功能缺失，細(xì)菌經(jīng)過細(xì)胞旁間隙進(jìn)入機(jī)體，這將促進(jìn)膿毒癥的發(fā)展進(jìn)程[11]。腸黏膜細(xì)胞與細(xì)胞間的常見連接方式有緊密、黏附、縫隙連接等[12]。ZO-1是緊密連接結(jié)構(gòu)的骨架成分，Occludin在維持緊密連接屏障中起關(guān)鍵作用，研究表明，在體內(nèi)和體外腸上皮細(xì)胞中，Occludin的缺失將導(dǎo)致大分子的選擇通透性增加[13，14]，造成腸道屏障功能損傷。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測結(jié)果提示：與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜中ZO-1蛋白和Occludin蛋白表達(dá)水平顯著降低，與膿毒癥組相比較，DEX組大鼠腸黏膜中ZO-1蛋白和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯升高。表明DEX參與促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)，證實(shí)了DEX的腸道黏膜保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證明膿毒癥大鼠腸損傷有Wnt/β-catenin信號通路參與，DEX參與并抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而發(fā)揮對腸道的保護(hù)作用，并調(diào)控相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放。同時(shí)，DEX對緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的調(diào)控作用，可改善腸道黏膜屏障的完整性，并抑制內(nèi)毒素和細(xì)菌的移位。因此得出結(jié)論，右美托咪定通過Wnt/β-catenin信號通路及緊密連接蛋白對膿毒癥腸黏膜屏障損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，這對于臨床治療膿毒癥具有積極意義。