FBXW7在食管癌組織中的表達及其對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

馬小平，蔡 爽，鄧朝偉，賈浴偵，Shaker Khan，趙凌宇

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，西安 710061；*通訊作者,E-mail:zhaolingyu@xjtu.edu.cn)

食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與飲食習(xí)慣、環(huán)境等有很大關(guān)系[1]。根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，較上一年，全球新增食管癌患者60多萬例，死亡人數(shù)達54萬多，而中國的發(fā)病人數(shù)占全球一半以上[2]。在幾種消化道癌中，食管癌的預(yù)后最差。由于早期診斷困難，大多數(shù)食管癌被發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，并存在對鄰近器官的直接侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這使得食管癌的治療非常困難[3]，最終導(dǎo)致晚期患者5年生存率不足20.0%[4,5]。因此尋找能用于食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物，對于食管癌的診斷和治療至關(guān)重要。

FBXW7是E3泛素連接酶中的核心F-box蛋白，是一種p53依賴的腫瘤抑制因子，參與降解多種癌蛋白，如Cyclin E、notch、c-Jun、c-Myc、mTOR[6]，進行泛素介導(dǎo)的蛋白水解，控制人類細(xì)胞周期進程、細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)展[7,8]。研究表明，在人類癌組織中觀察到FBXW7表達下調(diào)，包括乳腺癌、膀胱癌和宮頸癌，F(xiàn)BXW7的失活或下調(diào)可導(dǎo)致上述蛋白的失調(diào)，進而可能導(dǎo)致人類腫瘤發(fā)生以及化療耐藥的發(fā)展[9-13]。盡管FBXW7在多種腫瘤中被報道，參與多種生物進程，然而，F(xiàn)BXW7在食管癌中的作用及其功能還有待進一步探索。

本研究檢測了40例食管癌患者的食管癌組織和癌旁組織樣本中FBXW7的表達水平，探究FBXW7對食管癌的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期相關(guān)分子的影響，為闡明FBXW7在食管癌中的作用和功能奠定基礎(chǔ)，也為研究食管癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織收集及細(xì)胞培養(yǎng)

本研究自2018年6月至2019年3月間在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科收集食管癌患者手術(shù)后的食管癌組織和癌旁正常組織樣本各40例，提取總RNA和蛋白，用以分析FBXW7在食管癌腫的表達變化。

食管癌TE-1和EC9706細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5.0% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。TE-1細(xì)胞和EC9706細(xì)胞分別分為3組：陰性對照組、siRNA-1組和siRNA-2組，分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA(80 nmol/L)、FBXW7 siRNA-1(80 nmol/L)和FBXW7 siRNA-2(80 nmol/L)，用于后續(xù)的細(xì)胞行為學(xué)實驗。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒、化學(xué)增光劑購于美國Thermo fisher公司；MTT、RnaseA、PI、RIPA裂解緩沖液、Invitrogen Lipofectamine 2000購于美國Thermo fisher公司；FBXW7兔多克隆抗體和c-Myc兔單克隆抗體購于Thermo fisher公司(美國)；細(xì)胞周期蛋白D1小鼠單克隆抗體和小鼠單克隆抗GAPDH抗體購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；所有二抗購于美國Sigma公司；Annexin Ⅴ/FITC凋亡試劑盒購于美國BD-BioScience公司；FBXW7 siRNAs序列由中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

流式細(xì)胞儀為美國FALSCALIBARBD公司產(chǎn)品；全自動酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek公司；實時定量PCR儀、CO2培養(yǎng)箱、電泳儀、濕轉(zhuǎn)槽均為美國Bio-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 TCGA數(shù)據(jù)分析FBXW7在食管癌中表達

通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome altas, TCGA)與基因型-組織表達工程(the genotype-tissue expression project，GTEX)數(shù)據(jù)(https://xena.ucsc.edu)以食管-黏膜和食管-肌層為正常對照組織，分析FBXW7在食管癌組織中的表達，R language(4.1.1)用于數(shù)據(jù)的可視化。

1.4 siRNA合成與轉(zhuǎn)染

采用小干擾RNA(siRNAs)沉默人FBXW7基因用以研究其細(xì)胞學(xué)功能及分子機制。相關(guān)序列如下：①FBXW7 siRNA-1 sense：5′-GCACAGAAU-UGAUACUAACTT-3′，antisense：5′-GUUAGUAUC-AAUUCUGUGCTG-3′；②FBXW7 siRNA-2 sense：5′-CCUUAUAUGGGCAUACUUCTT-3′，antisense：5′-GAAGUAUGCCCAUAUAAGGTG-3′；③negative siRNA(NC-siRNA)sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACACGU-UCGGAGAATT-3′，均由GenePharma合成。在平板中培養(yǎng)TE-1和EC9706細(xì)胞24 h后，根據(jù)制造商的方案，使用LipofectamineTM2000將siRNA瞬時轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，用于探究FBXW7在TE-1和EC9706細(xì)胞中的生物功能及分子機制。

1.5 實時熒光定量PCR檢測食管癌組織和轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞中FBXW7 mRNA表達

采用實時定量PCR分別檢測40對食管癌組織和癌旁組織，以及轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs的TE-1和EC9706細(xì)胞中FBXW7 mRNA水平表達變化。根據(jù)生產(chǎn)制造商說明，使用TRIzol試劑提取人食管癌組織和轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs細(xì)胞的總RNA。以GAPDH為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt方法來分析FBXW7 mRNA的相對表達量。引物序列包括FBXW7上游引物：5′-AAAGAGTTGTTAGCGGTTCTCG-3′，下游引物：5′-CCACATGGATACCATCAAACTG-3′;GAPDH上游引物：5′-GCCACATTACTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGGTCAAATCC-3′。

1.6 MTT比色法檢測FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞增殖的影響

以1.1分組進行細(xì)胞培養(yǎng)，TE-1和EC9706細(xì)胞以2 000個細(xì)胞/孔分別接種于96孔板，每孔100 μl培養(yǎng)基，孵育24 h。每組5個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后再分別培養(yǎng)24，48，72 h，再每孔加10 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清并加入150 μl DMSO，利用酶標(biāo)儀在492 nm波長下檢測吸光度。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞周期的影響

以1.1分組進行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，TE-1和EC9706細(xì)胞以2×105個/孔分別接種于6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。然后用1 ml 70.0%冰冷乙醇4 ℃過夜固定。PBS洗滌2次，在室溫下用含50 μg/ml RNase A(無DNase)的50 μg/ml碘化丙啶染色細(xì)胞15 min。最后，通過流式細(xì)胞儀(FACS)檢測細(xì)胞內(nèi)PI含量，并用ModFit軟件(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)分析細(xì)胞周期不同時相細(xì)胞比例。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞凋亡的影響

以1.1分組進行細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，然后用PBS清洗2次。用300 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度為1×105/ml。取100 μl細(xì)胞懸液加入到5 ml流式管中，再加入5 μl 10 μg/ml Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml碘化丙啶，避光混勻，孵育15 min。在流式管中加入400 μl PBS。用流式細(xì)胞儀檢測染色細(xì)胞，采用ModFit軟件分析細(xì)胞凋亡。

1.9 Western blot分析食管癌組織中FBXW7的表達和FBXW7 siRNAs對FBXW7表達、c-Myc信號通路的影響

為了研究FBXW7在食管癌組織中的表達和FBXW7 siRNAs對TE-1和EC9706細(xì)胞中FBXW7表達、c-Myc信號通路的影響，采用Western blot檢測相關(guān)蛋白表達。使用RIPA裂解緩沖液裂解12例食管癌組織及12例癌旁組織和以1.1分組處理的細(xì)胞樣本。用10.0%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與FBXW7兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、c-Myc兔單克隆抗體(1 ∶2 000)、細(xì)胞周期蛋白D1小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)和小鼠單克隆抗GAPDH抗體(1 ∶4 000)4 ℃孵育過夜，洗膜，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h，洗膜。隨后用ECL試劑處理膜進行化學(xué)發(fā)光檢測。通過CCD相機檢測發(fā)光信號，并用Syngene GBox記錄并定量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FBXW7在食管癌組織中表達下調(diào)

與癌旁組織相比，食管癌組織中FBXW7 mRNA及蛋白水平表達均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1A和1B)。TCGA聯(lián)合GTEX數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW7在食管癌組織中低表達(P=0.021，見圖1C)。

與正常食管組織組比較，**P<0.01圖1 FBXW7在食管癌組織中的表達Figure 1 Expression of FBXW7 in esophageal carcinoma

2.2 食管癌細(xì)胞中沉默F(xiàn)BXW7的效率

在TE-1和EC9706細(xì)胞中，與陰性對照組相比，siRNA-1組和siRNA-2組FBXW7 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖2A)。同時與NC-siRNA組相比，siRNA-1組和siRNA-2組FBXW7蛋白表達也顯著下調(diào)(P<0.01，見圖2B和2C)。表明siRNA能有效沉默TE-1和EC9706細(xì)胞中FBXW7表達。

與陰性對照組比較，**P<0.01圖2 在食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs后FBXW7表達變化Figure 2 Changes of FBXW7 expression after transfection with FBXW7 siRNAs in esophageal carcinoma cells

2.3 轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞增殖的影響

在TE-1和EC9706細(xì)胞中，與陰性對照組相比，F(xiàn)BXW7 siRNAs組的OD492 nm值在48 h和72 h均顯著增加(P<0.01，見圖3)，表明沉默F(xiàn)BXW7后，TE-1和EC9706細(xì)胞增殖能力顯著增加。

A.轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs對TE-1細(xì)胞增殖影響B(tài).轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs對EC9706細(xì)胞增殖影響與陰性對照組比較，**P<0.01圖3 FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of FBXW7 siRNAs on the proliferation of esophageal carcinoma cells

2.4 轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞周期的影響

在TE-1和EC9706細(xì)胞中，與陰性對照組相比，F(xiàn)BXW7 siRNAs組G1/G0期細(xì)胞顯著減少(P<0.01)，而S期和G2/M期細(xì)胞顯著增加(P<0.01，見圖4，圖5)，表明沉默F(xiàn)BXW7后，可以促進TE-1和EC9706細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換。

與陰性對照組比較，**P<0.01圖4 沉默F(xiàn)BXW7對食管癌TE-1細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effect of FBXW7 siRNAs on cell cycle of esophageal carcinoma TE-1 cells

與陰性對照組比較，**P<0.01圖5 FBXW7 siRNAs對食管癌EC9706細(xì)胞周期的影響Figure 5 Effect of FBXW7 siRNAs on cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 cells

2.5 轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對照組相比，siRNA-1組和siRNA-2組TE-1和EC9706早期和晚期凋亡細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05，見圖6)。表明沉默F(xiàn)BXW7可以抑制TE-1和EC9706的凋亡。

與陰性對照組比較，*P<0.05圖6 FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 6 Effect of FBXW7 siRNAs on apoptosis of esophageal carcinoma cells

2.6 轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs調(diào)控c-Myc信號通路

為分析FBXW7作用的分子機制，采用Western blot分析沉默F(xiàn)BXW7對TE-1和EC9706細(xì)胞c-Myc和Cyclin D1表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照相比，沉默F(xiàn)BXW7后c-Myc和Cyclin D1蛋白表達均顯著上調(diào)(P<0.01，見圖7)。

A.TE-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs后c-Myc信號通路相關(guān)蛋白表達B.EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染FBXW7 siRNAs后c-Myc信號通路相關(guān)蛋白表達與陰性對照組比較，**P<0.01圖7 FBXW7 siRNAs對食管癌細(xì)胞中c-Myc信號通路的影響Figure 7 Effect of FBXW7 siRNAs on c-Myc signaling pathway in esophageal carcinoma cells

3 討論

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個從正常黏膜上皮細(xì)胞的不典型增生到原位癌再到浸潤癌的演變模式。由于食管癌早期癥狀不明顯，而且時隱時現(xiàn)，反復(fù)發(fā)作，不能很好地從影像學(xué)上診斷，加之缺乏能用于早期診斷的生物標(biāo)志物，患者大多數(shù)確診為晚期。因此，尋找有效的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)至關(guān)重要。眾所周知，腫瘤發(fā)生涉及多種分子和生物學(xué)過程的異常變化，泛素化就是其中較為重要的一種。與細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的蛋白，80.0%以上都通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)降解[9]，UPS失調(diào)可能導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生。因此對于該通路的調(diào)控已成為疾病治療中的一種創(chuàng)新性方法。在泛素化過程中，泛素蛋白與靶蛋白結(jié)合，需要泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)3種酶。研究表明，E3功能的調(diào)節(jié)是癌癥起始和進展的主要因素之一[14,15]。

FBXW7是SCF類泛素連接酶E3復(fù)合體中的關(guān)鍵因子，在轉(zhuǎn)錄水平受p53調(diào)節(jié)[16]。FBXW7負(fù)責(zé)識別和靶向泛素介導(dǎo)降解的各種癌蛋白(包括Cyclin E、c-Myc、c-jun和Notch-1)，從而調(diào)控細(xì)胞周期進程和細(xì)胞凋亡[8,17,18]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7在食管癌組織中低表達。突變、缺失和高甲基化使FBXW7失活，是導(dǎo)致癌癥進展的主要原因[7,19]。FBXW7在食管癌組織中表達下調(diào)可能是由于這些遺傳改變所引起的。于是，為了進一步研究FBXW7在食管癌中的作用，我們通過沉默食管癌中FBXW7的表達，發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞增殖能力顯著增強，G1/G0期細(xì)胞比例顯著減少，S期與G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，早期凋亡和晚期凋亡顯著減少，這與在乳腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的已有研究結(jié)果一致[20,21]，先前研究也表明FBXW7沉默促進癌細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化[22]，進而促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[23]。

c-Myc已被報道在許多人類癌癥中表達上調(diào)，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞代謝過程[24]。c-Myc的異常表達會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，因此，c-Myc蛋白的穩(wěn)定性受到嚴(yán)格控制。許多研究表明FBXW7表達下調(diào)致使其介導(dǎo)的泛素化降解蛋白質(zhì)作用喪失，從而導(dǎo)致c-Myc表達上調(diào)，并與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)[25]。我們的研究結(jié)果表明，在食管癌中敲低FBXW7，c-Myc及其下游Cyclin D1上調(diào)，這說明食管癌中FBXW7可能是通過c-Myc及其下游通路介導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞凋亡。

綜上所述，F(xiàn)BXW7在食管癌組織中表達下調(diào)，致使c-Myc信號通路激活促進食管癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，并抑制細(xì)胞凋亡。本研究初步探究了FBXW7在食管癌中的表達，生物學(xué)功能及其分子機制。對于FBXW7在食管癌中的分子作用網(wǎng)絡(luò)和臨床作用，還有待進一步研究和驗證。