添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤腐殖質(zhì)組成的影響

王 楠， 邵澤強， 馬 超， 吳柏恩， 馬 余， 王 帥

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 吉林 吉林 132101)

腐殖質(zhì)(HS)是土壤有機(jī)質(zhì)的主體部分， 是源于自然界的各類前體物質(zhì)在微生物作用下經(jīng)過一系列生物化學(xué)反應(yīng)形成的、 具有多相分布且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一類高分子化合物[1]. Maillard反應(yīng)以游離氨基和糖類的胺醛縮合開始， 伴隨一系列縮聚聚合和環(huán)化反應(yīng)， 最終生成暗色且難以生物降解的高分子有機(jī)物， 盡管結(jié)構(gòu)不同于HS[2]， 但Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對HS的形成有重要貢獻(xiàn). 通常經(jīng)過兩個階段形成HS： 第一階段為HS前體物質(zhì)的生成階段， 即有機(jī)質(zhì)分解形成HS的中間產(chǎn)物， 如多酚、 氨基酸、 多糖和還原糖等過程； 第二階段為前體物質(zhì)聚合形成HS的階段， HS前體物質(zhì)在微生物作用下， 通過多酚理論、 Maillard反應(yīng)等途徑聚合形成HS[3]， 其中最關(guān)鍵反應(yīng)為多酚的氧化縮合， 即通過微生物酶的氧化縮合作用， 以多酚、 糖類和氨基酸類小分子為起始物， 通過多酚-Maillard反應(yīng)路徑促進(jìn)HS形成. 因此， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)可促進(jìn)腐殖化進(jìn)程， 對HS形成有一定的激發(fā)效應(yīng)[4].

自然界中的木質(zhì)素儲量豐富， 其降解與HS形成關(guān)系密切[5]， HS的芳香性主要源自木質(zhì)素， 木質(zhì)素和蛋白質(zhì)可結(jié)合形成木質(zhì)素-蛋白質(zhì)復(fù)合體， 這是HS的核心[6]， 可見木質(zhì)素對HS形成的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于纖維素， 但木質(zhì)素的腐殖化進(jìn)程較緩慢， 導(dǎo)致秸稈還田培肥效果欠佳以及堆肥腐熟周期過長. 因此， 研究Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的激發(fā)效應(yīng)促進(jìn)以木質(zhì)素為主要成分的農(nóng)業(yè)廢棄物培肥土壤的效果具有重要意義. Fukuchi等[7]研究了天然沸石對鄰苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸間縮聚反應(yīng)的催化作用， 結(jié)果表明， 沸石促進(jìn)了縮聚反應(yīng); Hardie等[8]研究表明， 葡萄糖在δ-MnO2催化下可促進(jìn)鄰苯二酚的非生物腐殖化過程， 此外， 增加葡萄糖與鄰苯二酚和甘氨酸間的物質(zhì)的量比還可促進(jìn)類似于HS的高分子物質(zhì)產(chǎn)生； 文獻(xiàn)[9]研究表明， 堆肥過程主要以Maillard反應(yīng)合成HS； 文獻(xiàn)[10]研究表明， 有機(jī)物料在堆肥過程中均受Maillard反應(yīng)的影響； 文獻(xiàn)[11]研究表明， 在牛糞與甘蔗共堆肥過程中添加尾氣脫硫石膏后， 形成HS的芳香化和含氮化合物明顯增加.

木質(zhì)素難于腐解的特性影響了富含木質(zhì)素農(nóng)業(yè)廢棄物培肥土壤的效果， 目前Maillard反應(yīng)促進(jìn)堆肥腐殖化進(jìn)程的研究主要針對以木質(zhì)素為主要成分的椴木屑， 而探索Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對其添加暗棕壤腐殖化進(jìn)程的激發(fā)效應(yīng)目前尚未見文獻(xiàn)報道. 基于此， 本文采用室內(nèi)恒溫培養(yǎng)法， 通過添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)， 在接種微生物菌劑條件下， 探索各前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤腐殖質(zhì)組成的影響， 研究3種前體物質(zhì)對椴木屑在暗棕壤中的腐解特征及培肥效果的影響， 以期為椴木屑、 黑木耳菌糠、 秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物粉碎還田、 更好培肥土壤提供優(yōu)質(zhì)可行的助劑， 為農(nóng)業(yè)廢棄物催腐劑的研制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤采自吉林市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)猴石山海拔243 m的針闊混交林下， 土壤類型為暗棕壤； 椴木屑購于某木材商城. 葡萄糖、 鄰苯二酚、 甘氨酸等試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

微生物菌劑的制備： 準(zhǔn)確稱取秸稈腐熟劑(有效活菌數(shù)≥200億cfu/g， cfu為菌落數(shù)， 由木霉菌、 芽孢桿菌、 放線菌、 假單胞菌、 乳酸菌、 酵母菌、 纖維素酶和蛋白酶等組成， 天津環(huán)微生物科技有限公司)1.0 g于100 mL無菌水中， 在28 ℃氣浴振蕩器中以120 r/min振蕩提取2 h， 靜止沉降30 min后以3 500 r/min離心15 min， 收集上清液， 備用.

1.2 實驗設(shè)計

采用室內(nèi)恒溫培養(yǎng)法， 將45.0 g風(fēng)干、 磨細(xì)過0.25 mm篩的暗棕壤與5.0 g椴木屑粉末混勻， 用噴壺均勻噴灑一定濃度的(NH4)2SO4溶液(w(N)=27.2%)調(diào)節(jié)混料適宜的含水量(w(H2O)=60%)和m(C)∶m(N)(C，N比， 25∶1). 實驗共設(shè)3個處理， 在裝有混料的三角瓶中分別添加5 mL 0.12 mol/L的鄰苯二酚(catechol)、 葡萄糖(glucose)和甘氨酸(glycine)， 以無菌水為對照， 分別用Cat，Glu，Gly和CK表示， 每個處理重復(fù)3次后， 接種10 mL微生物菌劑， 用無菌透氣膜封口， 于28 ℃恒溫培養(yǎng)， 實驗期間動態(tài)補水， 在培養(yǎng)0，30，80，150 d時動態(tài)取樣， 取樣后立即轉(zhuǎn)入50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干， 終止微生物反應(yīng)， 磨細(xì)過0.25 mm篩， 用于腐殖質(zhì)組成分析.

1.3 測試方法

采用腐殖質(zhì)組成修改法[5]對動態(tài)采集混有椴木屑的暗棕壤試樣進(jìn)行水溶性物質(zhì)(water soluble substance， WSS)、 可提取腐殖酸(Humic-extracted acid， HE)、 胡敏酸(Humic acid， HA)、 富里酸(Fulvic acid， FA)及胡敏素(Humin， Hu)組分的提取， 同時測定各組分的含碳量(質(zhì)量比，w(C))， 對其中HA堿溶液進(jìn)行色調(diào)系數(shù)(ΔlogK)測定. 步驟如下： 準(zhǔn)確稱取1.0 g動態(tài)采集的混有椴木屑暗棕壤樣品于100 mL聚乙烯離心管中， 加入30 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍?在70 ℃恒溫水浴振蕩器上提取1 h， 離心(3 500 r/min， 15 min)， 將上清液過濾于50 mL容量瓶中， 在帶有殘渣的離心管中繼續(xù)加水20 mL攪拌均勻， 離心并將此次上清液與前次合并， 用蒸餾水定容， 所得溶液為WSS； 將蒸餾水替換為0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na2P2O7的混合溶液， 按上述步驟對殘渣進(jìn)行二次提取， 此次收集的溶液為HE； 離心管中殘渣用蒸餾水多次洗滌， 直至洗液近中性， 將其轉(zhuǎn)入50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒質(zhì)量， 得到Hu.

吸取30 mL HE溶液， 用0.5 mol/L的H2SO4將其pH值調(diào)至1.0～1.5， 置于70 ℃水浴鍋中保溫1.5 h， 靜置過夜， 次日將溶液過濾于50 mL容量瓶并定容， 得到FA溶液； 先用稀酸洗滌濾紙上的殘渣， 再用0.05 mol/L溫?zé)岬腘aOH將其溶解于50 mL容量瓶中， 用蒸餾水定容， 得到HA堿溶液， 各腐殖質(zhì)組分的有機(jī)碳(w(CWSS)，w(CHE)，w(CHA)，w(CHu))質(zhì)量比均用外加熱-重鉻酸鉀氧化法測定， 差減法計算w(CFA)=w(CHE)-w(CHA)， 并根據(jù)w(CHA)和w(CFA)的結(jié)果計算二者比值, 即為胡富比(w(CHA)/w(CFA)). 采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TU-1901型紫外可見分光光度計對HA堿溶液的光密度(A400 nm和A600 nm)進(jìn)行測定， 并計算ΔlogK：

ΔlogK=lgA400 nm-lgA600 nm.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并進(jìn)行差異顯著性分析， 采用Excel 2003軟件進(jìn)行繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 對混有椴木屑暗棕壤水溶性有機(jī)物碳質(zhì)量比及總有機(jī)碳的影響

圖1為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤w(CWSS)的影響. 由圖1可見， 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行， 包括CK在內(nèi)的4個處理， 其w(CWSS)均呈降低趨勢. 與未培養(yǎng)相比， 培養(yǎng)30，80，150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理條件下w(CWSS)的降低幅度分別為47.8%，43.0%，50.4%，36.2%； 53.5%，56.7%，56.4%，44.2%和60.7%，57.7%，64.1%，77.5%. 其中經(jīng)Gly處理培養(yǎng)30 d后的降低幅度最大， CK處理的降低幅度最小. 在培養(yǎng)80 d后， Glu處理的降低幅度最大， CK處理的降低幅度最小， 在培養(yǎng)150 d后， CK處理的降低幅度最大， Glu處理的降低幅度最小. 當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)處理均低于CK的w(CWSS)降低幅度， 其中添加Glu處理的w(CWSS)降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

圖2為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤TOC的影響. 由圖2可見， 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行， 各處理下混有椴木屑暗棕壤TOC均呈降低趨勢， 與未培養(yǎng)相比， 在Cat，Glu，Gly和CK處理下， 暗棕壤TOC分別降低了27.2%，20.6%，29.7%和25.2%， 其中Gly處理的降低幅度最大， 其次為Cat處理， 二者均高于CK的降低幅度， Glu處理的降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

2.2 對混有椴木屑暗棕壤可提取腐殖酸碳質(zhì)量比的影響

圖3為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤w(CHE)的影響. 由圖3可見， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的處理在各培養(yǎng)天數(shù)下w(CHE)均顯著高于CK處理， 且CK處理在各培養(yǎng)天數(shù)下w(CHE)均無顯著差異. 除CK處理外， 其余各處理w(CHE)均呈先降低后升高的趨勢. 與未培養(yǎng)相比， 培養(yǎng)150 d后Cat，Glu，Gly和CK處理下w(CHE)的降低幅度分別為4.22%，3.70%，1.52%和0.48%， 其中Cat處理下w(CHE)的降低幅度最大， CK處理下w(CHE)的降低幅度最小.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

2.3 對混有椴木屑暗棕壤胡敏酸碳質(zhì)量比的影響

圖4為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤w(CHA)的影響. 由圖4可見： 在Cat和Glu處理條件下,w(CHA)均呈先升高后降低的趨勢； 在Gly和CK處理條件下，w(CHA)呈逐漸降低的趨勢. 在培養(yǎng)150 d后， 混有椴木屑暗棕壤w(CHA)降低幅度分別為27.9%，20.8%，23.5%和19.2%， 可見， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)處理均高于CK的w(CHA)降低幅度.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

圖5為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤HA堿溶液ΔlogK的影響. ΔlogK是衡量腐殖質(zhì)組分光學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù)， 其與分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度呈反比， 即ΔlogK值越高， 分子結(jié)構(gòu)越簡單、 分子量越小[12]. 由圖5可見， 隨著培養(yǎng)時間的增加， 各處理下HA堿溶液ΔlogK變化規(guī)律不同， Glu和CK處理HA堿溶液ΔlogK逐漸增加， Cat處理HA堿溶液ΔlogK呈先降后升的趨勢， Gly處理呈先升后降的趨勢. 與未培養(yǎng)相比， 培養(yǎng)150 d后Cat，Glu，Gly，CK處理下HA堿溶液ΔlogK分別增加了6.5%，8.7%，1.8%和8.4%， 其中Glu處理的增加幅度最大， 大于CK處理， Gly處理的增加幅度最小. 可見， 添加Gly更有利于提高混有椴木屑暗棕壤HA分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度.

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2.4 對混有椴木屑暗棕壤胡富比的影響

圖6為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木屑暗棕壤胡富比(w(CHA)/w(CFA))的影響. 胡富比是評價腐殖質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo)， 胡富比越大， 表明腐殖質(zhì)品質(zhì)越好[13]. 由圖6可見， 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行， Cat，Glu和Gly 3個處理條件下， 混有椴木屑暗棕壤胡富比呈先升后降的趨勢， 在CK處理下， 胡富比呈降低趨勢. 與未培養(yǎng)相比， 在培養(yǎng)150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理下胡富比降低幅度分別達(dá)37.7%，27.5%，35.9%和32.7%， 其中Cat處理的降低幅度最大， 其次是Gly處理， Glu處理的降低幅度最小. 當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)和混有椴木屑暗棕壤的胡富比均顯著低于CK， 不利于提升腐殖質(zhì)品質(zhì).

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2.5 對混有椴木屑暗棕壤胡敏素碳質(zhì)量比的影響

圖7為添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)對混有椴木暗棕壤w(CHu)的影響. 由圖7可見， 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行， 除Cat處理下的w(CHu)先降低后略增加外， 其他3個處理下的w(CHu)均呈降低趨勢， 與未培養(yǎng)相比， 在培養(yǎng)150 d后， Cat，Glu，Gly和CK處理下的w(CHu)分別降低13.1%，32.7%，27.4%和27.7%， 其中Glu處理的降低幅度最大， 高于CK， Cat處理的降低幅度最小. 因此， 與CK相比， Glu處理更有利于w(CHu)的礦化分解， Cat處理更有利于w(CHu)的積累.

大寫字母表示同一天數(shù)、 不同處理間的差異分析結(jié)果； 小寫字母表示同一處理、 不同天數(shù)間的差異分析結(jié)果.

3 討 論

水溶性物質(zhì)(WSS)是微生物能迅速分解利用的底物， 在腐殖質(zhì)形成過程中起主要作用[14]， 總有機(jī)碳含量(TOC)是衡量土壤肥力的一個重要指標(biāo)[12]， 通常腐解過程伴隨TOC下降， 即TOC礦化分解為更穩(wěn)定的有機(jī)分子進(jìn)入腐殖質(zhì)(HS). 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行， 各處理下的暗棕壤水溶性物質(zhì)碳質(zhì)量比(w(CWSS))和TOC均呈降低趨勢， 其中， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)均低于CK暗棕壤w(CWSS)的降低幅度， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CWSS)和TOC的降低幅度達(dá)到最??； 各處理w(CWSS)降低的主要原因是微生物腐解暗棕壤中的椴木屑消耗了該能源物質(zhì)維系自身的生命活動所致[15]. 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的處理， 由于額外添加了部分能源物質(zhì)， 減少了對w(CWSS)的利用. 葡萄糖是微生物最易利用的碳源基質(zhì)， 因此， 添加葡萄糖更有利于緩解微生物對w(CWSS)的消耗， 此外， 添加葡萄糖也在一定程度上抑制了微生物對TOC的礦化分解. Gao等[16]研究表明， 多糖通過Maillard反應(yīng)可促進(jìn)酚類的腐殖化作用， HS的形成可減緩w(CWSS)和TOC的礦化.

可提取腐殖酸(HE)是腐殖質(zhì)中的活性部分， 具有較高的生物可利用性[1]. 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)均顯著高于CK的暗棕壤在培養(yǎng)期間可提取腐殖酸碳質(zhì)量比(w(CHE)). 可見， 鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸均有一部分經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)入HE組分， HE的形成主要源于前體物質(zhì)的聚合反應(yīng)， 添加前體物質(zhì)會促進(jìn)堆肥腐熟程度并提高HS的生成數(shù)量[4]. 培養(yǎng)前期微生物獲得外源物質(zhì)對HE進(jìn)行大幅度降解， 后期進(jìn)行縮合[17]， 因此使w(CHE)在培養(yǎng)期間呈先降低后升高的趨勢， 最終w(CHE)降低且降低幅度高于CK， 因此， 鄰苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸3種前體物質(zhì)對HE的降解作用大于縮合作用.

胡敏酸(HA)是腐殖質(zhì)中最活躍的組分， 在一定程度上可表征腐殖質(zhì)的芳香性、 化學(xué)穩(wěn)定性和有效性[18]， 其自然發(fā)生是由于多酚、 蛋白質(zhì)、 木質(zhì)素和糖等生物碎片的分解和轉(zhuǎn)化所致. 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的暗棕壤， 其胡敏酸碳質(zhì)量比(w(CHA))的降低幅度均高于CK， 即鄰苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸3種前體物質(zhì)對HA的降解作用大于縮合作用， 添加鄰苯二酚和甘氨酸可使HA分子結(jié)構(gòu)向復(fù)雜化方向進(jìn)行， 更有利于提高HA分子中的芳香基團(tuán). 甘氨酸是最簡單的氨基酸種類[19]， 鄰苯二酚易被氧化成鄰苯醌， 二者均可作為生物碎片加強HA分子的縮合， 使分子復(fù)雜程度有所提升[20].

富里酸(FA)是腐殖化反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物， 大多數(shù)HA通過FA進(jìn)一步聚合而成[21]， 研究胡富比變化可直接揭示堆肥過程中HS的演變規(guī)律[22]. 在本文實驗中， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的暗棕壤w(CHA)/w(CFA)均呈先增后減的趨勢， 最終有所降低， 添加葡萄糖的暗棕壤低于CK的w(CHA)/w(CFA)降低幅度. 從該規(guī)律可以推斷， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)增加了微生物的降解能力， 使FA組分趨于降解， 然后部分FA發(fā)生縮合進(jìn)入HA組分， 添加葡萄糖更有利于促進(jìn)土壤有機(jī)碳活化與更新、 改善腐殖質(zhì)品質(zhì)[23]. 也可理解為HA比FA形成更早， 符合木質(zhì)素-蛋白質(zhì)理論和微生物合成學(xué)說[6].

胡敏素(Hu)是腐殖質(zhì)中的惰性物質(zhì)[24]， 具有比HA和FA更大的分子量和更高的聚合度， 表明Hu的穩(wěn)定性更強[3]. 各處理下的暗棕壤胡敏素碳質(zhì)量比(w(CHu))經(jīng)培養(yǎng)均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于w(CHu)的礦化分解， 鄰苯二酚可在某種程度上促進(jìn)碳固存， 抑制w(CHu)降解， 原因可能是添加鄰苯二酚增加了微生物的降解負(fù)擔(dān)、 削弱了對CHu的降解所致[25]. 可見， 添加葡萄糖可顯著提高微生物的降解能力， 使Hu中的酰胺和多糖物質(zhì)被微生物用作碳源[16]， 促進(jìn)了惰性腐殖質(zhì)組分Hu的降解并向活性腐殖質(zhì)組分轉(zhuǎn)化.

4 結(jié) 論

1) 隨著室內(nèi)培養(yǎng)的進(jìn)行， 混有椴木屑的暗棕壤在各處理影響下， 水溶性物質(zhì)及總有機(jī)碳含量均呈降低趨勢， 其中， 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)使暗棕壤水溶性物質(zhì)的降低幅度減小， 添加葡萄糖使水溶性物質(zhì)及總有機(jī)碳含量的降低幅度最小.

2) 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)的暗棕壤在培養(yǎng)期間可提取腐殖酸碳質(zhì)量比均顯著高于CK處理， 呈先降低升的趨勢， 經(jīng)培養(yǎng)后可提取腐殖酸碳質(zhì)量比有所降低且降低幅度高于CK處理； 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)使暗棕壤胡敏酸碳質(zhì)量比的降低幅度更大， 其中， 添加鄰苯二酚和甘氨酸使胡敏酸分子結(jié)構(gòu)向復(fù)雜化方向進(jìn)行. 添加Maillard反應(yīng)前體物質(zhì)暗棕壤的w(CHA)/w(CFA)均呈先增后減的趨勢， 最終降低， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CHA)/w(CFA)降低幅度低于CK處理.

3) 各處理條件下暗棕壤w(CHu)經(jīng)培養(yǎng)后均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于胡敏素的礦化分解.