微生物發(fā)酵法脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝優(yōu)化

陽暉，陳明月，龔乃霞，曹沁倩，張川雨，李昌滿

長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（重慶 408100）

蘿卜紅色素是一種天然色素。它具有安全、無毒的特點，同時還兼具一定的營養(yǎng)價值和藥理作用[1]。但是由于蘿卜在咀嚼或加工過程中內(nèi)源酶水解硫代葡萄糖苷產(chǎn)生異味，因此現(xiàn)有工藝制備的蘿卜紅色素常帶有異味[2-3]。這種異味成為限制其在食品工業(yè)中應(yīng)用的主要因素，研究蘿卜紅色素的高效脫異味技術(shù)迫在眉睫[4]。

基于上述難點，各國研究者對蘿卜紅色素的脫臭工藝進(jìn)行深入研究。陳亞平等[5]經(jīng)過酸、酶制劑、穩(wěn)定劑、調(diào)節(jié)劑和樹脂處理等過程制得一種產(chǎn)率高、色素保留完全的脫味蘿卜紅色素。陳文田等[6-7]采用酸化有機(jī)介質(zhì)法高效地去除蘿卜色素中的異味。湯川千代樹等[8]研發(fā)一種特殊的專用脫臭技術(shù)進(jìn)行除味來獲得可以進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的脫味蘿卜紅色素。Rodriguez- Saona等[9]采用一種特殊的設(shè)備成功地吸附了蘿卜色素中的異味。除上述方法外，去除異味的方法還包括超臨界二氧化碳萃取法[10-12]、吸附法[13-16]、酶解法[17-19]、沉淀法[20]和膜分離法[21-22]等。但這些方法都存在一些不足。如理化脫味法脫味范圍都較小，脫味率低，脫味后會影響蘿卜紅色素的提取率和穩(wěn)定性，脫臭效果并不理想。而生物學(xué)脫味法可分為酶解法和微生物脫味法，但添加酶制劑成本較高，且不能從根本上脫除異味[23-24]。微生物脫異味效果較好，還有具有操作簡單、成本低廉、不污染環(huán)境等優(yōu)點，是脫除蘿卜色素異味的理想選擇[25]。

試驗選取果酒酵母為發(fā)酵菌種，對胭脂蘿卜紅色素中異味進(jìn)行脫除，并優(yōu)化脫味工藝，以期獲得一種脫味效果好、色價高、可用于工業(yè)化生產(chǎn)的脫除蘿卜紅色素異味的工藝，為擴(kuò)大蘿卜紅色素的適用范圍奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂蘿卜（涪陵農(nóng)貿(mào)市場）；葡萄酒、果酒專用酵母RW（安琪酵母股份有限公司）；檸檬酸、濃鹽酸（濰坊英軒實業(yè)有限公司）；酒石酸（食品級，滕州市香凝生物工程有限責(zé)任公司）；乙酸鈉（重慶傅藝化學(xué)試劑有限公司）；氯化鉀（成都市科龍化工試劑）。

CX-12000組織破碎機(jī)（東莞市南城長協(xié)電子制品廠）；H30FK802-136高壓滅菌鍋（東莞市星辰電器貿(mào)易有限公司）；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SB-4200 DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RV 10 B S25真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；CS101-2ABN電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶市永生實驗儀器廠）；ZD-F20真空冷凍干燥器（南京載智自動化設(shè)備有限公司）；PHS-3C pH計（上海虹益儀器儀表有限公司）；V-1800可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫臭蘿卜紅色素制取的工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 勻漿

將胭脂蘿卜丁、蒸餾水按料液比1∶1（W/W）進(jìn)行勻漿，備用。

1.2.2.2 調(diào)pH、滅菌

用5%檸檬酸將蘿卜勻漿調(diào)節(jié)pH后，在121 ℃，滅菌30 min。

1.2.2.3 制備菌懸液、接種、發(fā)酵

將果酒酵母菌粉和加入10倍無菌水混勻，在30 ℃，活化10～20 min，制備成菌懸液。按一定接種量接種加入到胭脂蘿卜發(fā)酵液中，在轉(zhuǎn)速160 r/min搖床中發(fā)酵。

1.2.2.4 超聲提取

在超聲溫度30 ℃、超聲時間40 min、超聲功率400 W條件下進(jìn)行蘿卜紅色素提取[26]。

1.2.2.5 測定紅色素含量

在最大吸收波長530 nm處測定蘿卜紅色素的含量[27]。

1.2.2.6 旋蒸、凍干

將蘿卜紅色素提取液在轉(zhuǎn)速120 r/min、溫度35 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至黏稠。將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥至恒重，得到脫臭型蘿卜紅色素。

1.2.3 單因素試驗

固定酵母菌的接種量1%、初始pH 4.5、發(fā)酵溫度26 ℃、發(fā)酵時間36 h，考察發(fā)酵時間（12，24，36，48和60 h）、發(fā)酵液初始 pH（3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、發(fā)酵溫度（22，24，26，28和30 ℃）以及酵母菌的接種量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH對蘿卜紅色素有重要影響的因素，以感官評分為響應(yīng)值，采用Design Expert 12軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝。響應(yīng)面設(shè)計的水平因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗水平因素表

1.2.5 質(zhì)量指標(biāo)測定

1.2.5.1 感官評價

由20名食品專業(yè)學(xué)生按照表2進(jìn)行感官評價。

表2 蘿卜紅色素異味的感官評分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)張梓涵等[27]的方法，對蘿卜紅色素的提取量進(jìn)行測定。量取20 mL蘿卜發(fā)酵液B，平均分成2份，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液（pH 1緩沖液：稱取1.86 g氯化鉀、980 mL蒸餾水，攪拌均勻，用濃鹽酸進(jìn)行pH矯正；pH 4.5緩沖液：稱取32.82 g乙酸銨、960 mL蒸餾水，攪拌均勻，用濃鹽酸進(jìn)行pH矯正）定容至50 mL，靜置后在最大吸收波長530 nm處測定其吸光度，根據(jù)公式計算其色素提取量并進(jìn)行比較。計算方式見式（1）。

式中：C為色素提取量，mg/g；A0是pH 1.0時色素在530 nm處的吸光度；A1是pH 4.5時色素在530 nm處的吸光度；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為天竺葵素的相對分子量，取值648.5；ε為消光系數(shù)，取值30 200）；m為胭脂蘿卜的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖1所示，發(fā)酵溫度極大地影響脫異味的效果。這是由于蘿卜紅色素的主要異味物質(zhì)來源是蘿卜中硫代葡萄糖苷化合物的分解代謝產(chǎn)物，如3-丁烯-1-異硫氰酸酯、3-（甲硫基）-丙基異硫氰酸酯和4-（甲硫基）-3-丁烯基異硫氰酸酯等[28]。在適宜的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，酵母菌在代謝過程中，減少了這些異味物質(zhì)的產(chǎn)生，因此降低了蘿卜紅色素中的異味。隨著溫度逐漸升高，蘿卜紅色素的異味呈先減少后增加趨勢，發(fā)酵溫度26 ℃時，感官評價分?jǐn)?shù)最高。在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度對蘿卜紅色素提取率的影響不大（P＜0.05）。發(fā)酵溫度為24 ℃時，蘿卜紅色素的提取量最高，為0.026 mg/g。僅比對照組相差0.000 4 mg/g。綜上所述，從資源利用度方面綜合考慮，選擇溫度24，26和28 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖1 發(fā)酵溫度對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量影響

2.1.2 發(fā)酵時間對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖2所示，發(fā)酵時間12 h時，紅色素提取量比對照組的提取量略有增加，為0.028 8 mg/g，其原因是在這個階段處于發(fā)酵的初始階段，不但不會引起紅色素的降解，反而有利于紅色素從蘿卜細(xì)胞中的溶出。發(fā)酵時間36 h時，感官評分達(dá)到最高值，為7.5分。發(fā)酵時間超過36 h，感官評分逐漸降低，發(fā)酵液中出現(xiàn)新異味，這可能是酵母過度發(fā)酵，產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物所致。另外，低糖濃度及其降解副產(chǎn)物會降低花青素穩(wěn)定性，并形成棕色聚合物；高糖濃度可能會降低水分活性，從而對花青素的活性有保護(hù)作用[29]。綜上所述，選擇發(fā)酵時間24，36和48 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖2 發(fā)酵時間對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.1.3 發(fā)酵液初始pH對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖3所示，當(dāng)發(fā)酵液初始pH 4.5時，感官評定分?jǐn)?shù)和紅色素提取量均達(dá)到最高，分別為8分和0.027 3 mg/g。這可能是發(fā)酵pH影響了胭脂蘿卜中硫苷酶的活性，黑芥子酶的最適pH為6，研究發(fā)現(xiàn)pH下降至3左右時其活性降低70%[11]。發(fā)酵液處于低pH時黑芥子酶受到抑制作用和對硫苷的分解，從而影響了蘿卜色素中異味物質(zhì)的產(chǎn)生。同時，當(dāng)pH超過4.5時，紅色素的提取量逐漸降低，這可能是花青素結(jié)構(gòu)由穩(wěn)定的醌式結(jié)構(gòu)逐漸變成無色的不穩(wěn)定的擬堿式或者查爾酮式形式，導(dǎo)致蘿卜紅色素溶解度下降所致[30]。綜上所述，選擇發(fā)酵液初始pH 4.5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 發(fā)酵液初始pH對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.1.4 接種量對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖4所示，當(dāng)酵母菌接種量不斷提高時，蘿卜紅色素異味先減少后增加。接種量1%時，感官評價分?jǐn)?shù)最高，為8分。接種量超過1%時，感官評分逐漸降低。這可能是隨酵母菌接種量增大，發(fā)酵速率變快，代謝加強(qiáng)，菌種之間競爭激烈，代謝路徑發(fā)生改變，影響硫苷分解后的代謝產(chǎn)物種類、含量，增加異味物質(zhì)的種類和含量；同時，可能酵母菌利用蘿卜中的糖類物質(zhì)，生產(chǎn)一些新的異味物質(zhì)。菌種量1.2%時，紅色素提取量最高，為0.023 9 mg/g。綜上所述，選擇接種量0.8%，1.0%和1.2%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 接種量對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.2 微生物發(fā)酵法脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗安排及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗安排與結(jié)果

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

通過Design-Expert 12軟件對回歸模型進(jìn)行分析，得出擬合回歸方程：感官評分=7.85+0.050A-0.003 333B-0.20C+0.036D-0.30AB-0.12AC-0.36AD-0.25BC-0.056BD-0.13CD-1.08A2-92B2-1.16C2-1.31D2。

由表4可知，對回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗和方差分析。該模型P＜0.01，說明該模型極顯著。失擬項P值為0.106 9＞0.05不顯著，確定系數(shù)R2=0.990 5，模型變異系數(shù)為2.1%，遠(yuǎn)小于10%。說明該模型擬合度較好、可信度高、相關(guān)性好，可用于有效預(yù)測蘿卜紅色素異味的感官評分變化情況，進(jìn)而有效驗證工藝的準(zhǔn)確性。模型中C、AB、AD、BC、A2、B2、C2、D2均極顯著（P＜0.01），BC顯著（P＜0.05）。從表4中F值可知，各因素對蘿卜紅色素異味的影響順序為：發(fā)酵時間（C）＞接種量（A）＞發(fā)酵液pH（D）＞發(fā)酵溫度（B）。

表4 響應(yīng)面回歸方程方差分析

接表4

2.2.3 交互作用分析

圖6 接種量和發(fā)酵液初始pH的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

圖5～圖7中響應(yīng)面坡度均較陡峭，等高線呈橢圓形，說明發(fā)酵時間與菌種接種量、發(fā)酵pH與接種量以及發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用均顯著，對感官評分的影響較大。這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 接種量和發(fā)酵時間的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

圖7 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

2.2.4 驗證試驗結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面模型預(yù)測微生物發(fā)酵法脫除蘿卜紅色素異味的最佳工藝參數(shù)：菌種接種量1.005%、發(fā)酵時間36.071 h、發(fā)酵溫度為25.821 ℃、發(fā)酵液初始pH 4.507，按此工藝參數(shù)制備的蘿卜紅色素的感官評分可達(dá)7.854分。考慮到實際操作的簡便性，將試驗方案適當(dāng)調(diào)整為酵母菌接種量1%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度25.5 ℃、發(fā)酵液初始pH 4.5。按此工藝進(jìn)行3次平行試驗，感官評分為7.82±3分，與預(yù)測值7.854分接近，說明該模型適合紅色素脫臭工藝條件的預(yù)測。

2.3 質(zhì)量評價

2.3.1 感官指標(biāo)

胭脂蘿卜紅色素異味的感官指標(biāo)：無胭脂蘿卜異味，酵母發(fā)酵味淡；脫臭蘿卜紅色素的色澤鮮艷，與未脫臭的蘿卜紅色素相比較，無明顯差異。

2.3.2 紅色素提取量

在最優(yōu)脫異味工藝條件下制備的紅色素的提取量達(dá)到0.036 3 mg/g，而對照試驗的紅色素提取量為0.037 1 mg/g。由此可見，微生物發(fā)酵法不僅可以有效脫異味，而且對蘿卜紅色素的提取量無顯著（P＞0.05）影響。

3 結(jié)論

試驗采用果酒酵母發(fā)酵脫除胭脂蘿卜紅色素異味。通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定脫除蘿卜紅色素異味的最優(yōu)工藝參數(shù)：菌種接種量1%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度25.5 ℃、發(fā)酵液初始pH 4.5。在此條件下制得的蘿卜紅色素基本無胭脂蘿卜異味，酵母發(fā)酵味淡，感官評分是7.82分，紅色素提取量為0.036 3 mg/g，與未脫臭的蘿卜紅色素提取量無顯著差異（P＞0.05）。說明果酒酵母菌發(fā)酵不僅能有效脫除蘿卜紅色素中的異味，而且基本不會影響蘿卜紅色素提取量和色澤。試驗建立一種新的減少或消除胭脂蘿卜紅色素的異味方法，為擴(kuò)大蘿卜紅色素的應(yīng)用范圍提供技術(shù)支持，為蘿卜紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供方法指導(dǎo)和理論基礎(chǔ)。