13 種殺菌劑對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌及混配效果測定*

李 黎，潘 慧，李文藝，鄧 蕾，陳美艷，鐘彩虹

（中國科學院獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實驗室，中國科學院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室，中國科學院種子創(chuàng)新研究院，中國科學院武漢植物園，湖北 430074）

獼猴桃細菌性潰瘍病（kiwifruit bacterial canker，簡稱潰瘍?。┦且环N嚴重威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的毀滅性病害，致病性強、傳播快、根除難。2020 年，經(jīng)申請人團隊調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該病在我國陜西、四川、廣西、貴州及湖南等省份均已發(fā)生，累計感病面積超過百萬畝，平均病株率超過40%，特別是商品價值最高、栽培面積最大的黃肉和紅肉品種遭受危害尤其嚴重，死樹、毀園情況頻發(fā)，潰瘍病已成為我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大限制因素[1-2]。近年來，國內(nèi)已有大量研究通過室內(nèi)抑菌試驗和田間試驗比較了不同殺菌劑對獼猴桃潰瘍病的防效。部分藥劑被認為具有較好的防效，如中生菌素、可殺得3000、四霉素、葉枯唑、噻霉酮及溴硝醇等[3-8]。本文對已報道有效的13 種常用殺菌劑進行了統(tǒng)一條件下的室內(nèi)抑菌效果測定及混配藥劑的增效作用分析，以期獲得防效較好的藥劑組合，為獼猴桃潰瘍病防治及農(nóng)藥減施增效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病菌：丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，簡稱Psa）C48菌株，分離自湖南常德東山峰農(nóng)場的高致病菌株。

供試的13 種獼猴桃潰瘍病常用防治藥劑：2%春雷霉素水劑，華北制藥集團愛諾有限公司；0.15%四霉素（梧寧霉素）水劑，遼寧微科生物工程股份有限公司；47%春雷王銅可濕性粉劑，日本北興化學工業(yè)株式會社；46%可殺得3000 水分散粒劑，美國杜邦公司；3%中生菌素可濕性粉劑，福建凱立生物制品有限公司；86.2%銅大師水分散粒劑，挪威勞道克斯公司；33.5%喹啉銅懸浮劑，浙江海正化工股份有限公司；30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑，齊齊哈爾四友化工有限公司；80%乙蒜素乳油，開封大地農(nóng)化生物科技有限公司；20%葉枯唑可濕性粉劑，湖北蘄農(nóng)化工有限公司；80%波爾多液可濕性粉劑，通州正大農(nóng)藥化工有限公司；45%代森銨水劑，湖北雙吉化工有限公司；30%堿式硫酸銅懸浮劑，保定農(nóng)藥廠。

1.2 方法

1.2.1 13 種殺菌劑對潰瘍病菌的抑菌率測定

（1）藥劑質(zhì)量濃度設(shè)定。基于已發(fā)表文獻推薦的最佳田間使用方法，設(shè)定各藥劑的稀釋濃度：2%春雷霉素水劑500 倍液，0.15%四霉素水劑600 倍液，47%春雷王銅可濕性粉劑500 倍液，46%可殺得3000 水分散粒劑1 500 倍液，3%中生菌素可濕性粉劑800 倍液，86.2%銅大師水分散粒劑1 000 倍液，33.5%喹啉銅懸浮劑1 500 倍液，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑300 倍液，80%乙蒜素乳油4 000 倍液，20%葉枯唑可濕性粉劑600 倍液，80%波爾多液可濕性粉劑400 倍液，45%代森銨水劑150 倍液，30%堿式硫酸銅懸浮劑300 倍液。用KB 液體培養(yǎng)基將藥劑稀釋至相應(yīng)濃度備用（10 mL 甘油，1.5 g K2HPO4，20 g 胰蛋白胨Oxoid，去離子水1 L）。

（2）菌懸液的制備及抑菌率測定。刮取C48病菌于50 mL KB 液體培養(yǎng)基三角瓶中，置于28 ℃、150 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h。采用紫外分光光度計法，配制濃度OD600為0.2 的菌懸液，取1 mL 接種于含相應(yīng)濃度藥劑的50 mL KB 培養(yǎng)液中（另加入160μL 1 mol/L MgSO4）。然后，將三角瓶置于28 ℃、180 r/min 的搖床中培養(yǎng)3 d；以不加藥劑的KB 培養(yǎng)液作對照，每個處理3 次重復。隨后，分別從對照及各藥劑處理的菌懸液中取2 mL 于10 mL 離心管中8 000 r/min 離心10 min，去上清，取沉淀，并加入2 mL 無菌水，振蕩，重懸菌體。以2 mL 無菌水作參比調(diào)零，將2 mL 含有不同藥劑處理后的菌懸液置于比色皿中，記錄OD600值，計算各處理藥劑的抑菌率。

抑菌率（%）＝［（OD2-OD1）/OD2］×100

其中OD1代表各藥劑處理的OD 值，OD2代表KB 培養(yǎng)液對照的OD 值。

1.2.2 7 種殺菌劑二元混配對潰瘍病菌的抑菌率測定

將抑菌率排列在前7 位的防治藥劑按照體積比進行1∶1 二元混配，共設(shè)置21 個組合，按照1.2.1方法計算對應(yīng)的生長抑菌率。

1.2.3 3 種殺菌劑三元混配對潰瘍病菌的抑菌率測定

基于農(nóng)藥混配原則，對篩選得到的3 種最高效且可混配藥劑（春雷霉素∶四霉素∶乙蒜素）按體積比設(shè)置1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2共4個配比，根據(jù)1.2.1方法計算對應(yīng)的生長抑菌率。

1.2.4 3 種高效殺菌劑對潰瘍病菌的單劑毒力測定

設(shè)定3 種藥劑的質(zhì)量濃度梯度，2%春雷霉素水劑：112.5、225、450、900、1 800 mg/L；0.15%四霉素水劑：48、66、88 mg/L；80%乙蒜素乳油：26、38、42、46 mg/L。分別將各藥劑用KB 液體培養(yǎng)基稀釋到所需質(zhì)量濃度備用，各濃度重復3 次。根據(jù)1.2.1 方法，測定3 種藥劑不同質(zhì)量濃度梯度處理的OD 值，求出生長抑菌率。同時，計算各藥劑對病菌的有效抑制中質(zhì)量濃度EC50值及EC95值；以藥劑質(zhì)量濃度值為x，菌株生長抑菌率值為y，建立不同藥劑質(zhì)量濃度對菌株的毒力回歸直線方程，計算相關(guān)系數(shù)r。

1.2.5 4 種混配藥劑對潰瘍病菌的聯(lián)合毒力測試

在單劑毒力測定的基礎(chǔ)上，將乙蒜素∶春雷霉素∶四霉素按體積比設(shè)置1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2 共4 個配比，按上述方法確定混配藥劑對菌株的生長抑制率、EC50值及EC95值，各濃度重復3 次。計算混配劑的共毒系數(shù)CTC，評價混配藥劑的協(xié)同增效作用。

毒力指數(shù)TI＝（標準藥劑EC50/供試藥劑EC50）×100

混配劑實際毒力指數(shù)ATI＝（標準藥劑EC50/混配制劑EC50）×100

混配劑理論毒力指數(shù)TTI＝單劑A 的TI×PA＋單劑B的TI×PB

PA 和PB 分別為混配劑中有效成分的百分含量。

共毒系數(shù)CTC＝（混配劑實際毒力指數(shù)ATI/混配劑理論毒力指數(shù)TTI）×100

增效作用判斷：CTC≥120 具有增效作用，80＜CTC＜120 為相加作用，CTC≤80 為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 13 種殺菌劑對潰瘍病菌的抑菌率

將13 種常用防治藥劑進行室內(nèi)抑菌率分析，發(fā)現(xiàn)其中7 種藥劑對潰瘍病防效較高，分別為80%乙蒜素乳油4 000 倍液、0.15%四霉素水劑600 倍液、2%春雷霉素水劑500 倍液、86.2%銅大師水分散粒劑1 000 倍液、3%中生菌素可濕性粉劑800 倍液、46%可殺得3000 水分散粒劑1 500 倍液及45%代森銨水劑150 倍液。前5 種藥劑的抑菌率高于50%，其中80%乙蒜素的平均抑菌率高達92.56%，0.15%四霉素及2%春雷霉素的平均抑菌率分別為85.64%及69.34%，不論單劑或者混配使用均具有非常強的防治應(yīng)用前景。其他6 種藥劑47%春雷王銅可濕性粉劑500 倍液、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑300 倍液、80%波爾多液可濕性粉劑400 倍液、30%堿式硫酸銅懸浮劑300 倍液、20%葉枯唑可濕性粉劑600倍液及33.5%喹啉銅懸浮劑1 500 倍液對潰瘍病菌的抑制效果不明顯，不適用于潰瘍病的防治（表1）。

表1 13 種常用細菌殺菌劑對潰瘍病菌的室內(nèi)抑制效果

2.2 7 種殺菌劑二元混配對潰瘍病菌的抑菌率

為初步分析混配藥劑是否可提高藥劑的防治效率，將抑菌率排列在前7 位的藥劑按照體積比進行1∶1 二元混配，共得到21 個混配組合，具體混配抑制效果見表2。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙蒜素與多種藥劑混配后抑菌率上升，乙蒜素單劑的抑菌率為92.56%，與代森銨、銅大師、四霉素、春雷霉素、可殺得3000 混配后抑菌率分別上升至96.32%、93.75%、93.61%、93.41%及93.09%，但與中生菌素混配抑菌率卻下降至83.11%。四霉素除與乙蒜素具有良好的混配效果外，與可殺得3000、春雷霉素及銅大師混配后抑菌率也有所上升，分別從單劑的85.64%提高至95.91%、92.49%及86.27%，但不適宜與中生菌素、代森銨混配。春雷霉素與乙蒜素、四霉素、可殺得3000、中生菌素及代森銨混配后抑菌率均有所上升，分別從單劑的69.34%提高至93.41%、92.49%及82.80%、80.93%及71.33%，但不適合與銅大師進行混配。由此說明，農(nóng)藥混配不可隨意進行，需根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳混配組合才能達到減施增效的目的。

表2 21 種二元混配藥劑對潰瘍病菌的室內(nèi)抑制效果

2.3 3 種殺菌劑及三元混配對潰瘍病菌的單劑或聯(lián)合毒力

由于可殺得3000、銅大師為銅制劑，呈堿性，代森銨呈中性或弱堿性，而其他常規(guī)農(nóng)藥呈酸性，因此不適宜進行混配?；?.2 的結(jié)果及藥劑成分、酸堿度及混配原則等多方面考慮，最終確定運用乙蒜素、春雷霉素、四霉素進行不同比例的三元混配。為進一步確認混配藥劑的增效作用，首先，對單劑進行毒力測試，分別得到3 種藥劑的EC50值、毒力回歸直線方程，計算相關(guān)系數(shù)r、EC50值及95%置信限。結(jié)果表明，3 種藥劑的EC50值及EC95值與平均抑菌率趨勢一致，抑菌效果依次為乙蒜素＞四霉素＞春雷霉素（表3）。

表3 潰瘍病菌對乙蒜素、春雷霉素、四霉素的敏感性

隨后，測試了4 種不同比例的乙蒜素、春雷霉素、四霉素混配藥劑的共毒參數(shù)，發(fā)現(xiàn)4 種不同比例混配組合的CTC 值均大于120，表現(xiàn)為增效作用。其中當混配體積比為1∶1∶2 時抑菌率達99.14%，CTC 值高達247.567 0，為最佳混配比例（表4）。

表4 三元混配比例藥劑對潰瘍病菌的抑制效果及共毒系數(shù)

3 討論與結(jié)論

近10 年來，潰瘍病在各主產(chǎn)國持續(xù)暴發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失，盡快找到最佳的潰瘍病防治方法已成為全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)最迫切的需求。國內(nèi)外對潰瘍病的防治主要依賴硫酸鏈霉素及銅制劑，但2011 年開始硫酸鏈霉素逐步停止使用，銅制劑也證實會導致潰瘍病菌耐藥性增強[9]。目前，國內(nèi)外的潰瘍病用藥仍處在摸索階段，尚未開發(fā)出在各主產(chǎn)區(qū)均防效明顯的綠色、高效防治藥劑。本文對13種前期已報道的潰瘍病防治藥劑進行了統(tǒng)一條件下的抑菌效果評價，篩選出7 種抑菌率相對較高的藥劑，其中80%乙蒜素乳油4 000 倍液、0.15%四霉素水劑600 倍液及2%春雷霉素水劑500 倍液3 種單劑對潰瘍病的抑菌效果最好。

乙蒜素系大蒜提取物，是一種低成本、高效、內(nèi)吸、低毒、低殘留的植物源仿生結(jié)構(gòu)的綠色農(nóng)藥，能抑制多種病原真菌或細菌生長[10]。高蓬明等[11]發(fā)現(xiàn)30%乙蒜素對獼猴桃潰瘍病菌有一定抑菌效果；胡容平等[12]證實80%乙蒜素室內(nèi)抑菌效果明顯優(yōu)于其他9 種藥劑，稀釋400 倍噴霧的田間防效達到68.77%，灌根＋涂干防效達到71.41%。本研究結(jié)果顯示乙蒜素單劑對潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌率達到92.56%。乙蒜素及其配套使用方法在獼猴桃潰瘍病防治方面具有非常好的應(yīng)用前景和推廣價值。

四霉素為不吸水鏈霉素梧州亞種的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，含有多種抗菌素，殺菌譜廣，已證實對26種植物病原菌均有極強的殺滅作用。黃露等[13]發(fā)現(xiàn)0.3%四霉素對潰瘍病的田間防效可達到71.06%。陽廷密等[14]通過室內(nèi)毒力測試、田間枝干病斑涂抹及葉片噴霧試驗，發(fā)現(xiàn)0.15%四霉素對潰瘍病的防效在80%以上。焦紅紅[15]證實四霉素對潰瘍病菌的室內(nèi)殺菌效果優(yōu)于其他30 種農(nóng)藥，且在活體嫁接苗及田間的防效均十分穩(wěn)定。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四霉素單劑對潰瘍病菌的抑菌率僅略低于乙蒜素，達到85.64%，對潰瘍病具有較好的防治效果。

春雷霉素是由小金放線菌產(chǎn)生的一種生物殺菌劑，具有較強的內(nèi)吸性，兼具預防和治療作用，可有效用于防治蔬菜、瓜果和水稻等作物的多種細菌和真菌性病害。張鋒等[16]分析發(fā)現(xiàn)單獨使用春雷霉素對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌效果并不明顯。鄢明峰[8]研究證實四霉素對潰瘍病的抑菌作用高于春雷霉素。本研究結(jié)果也顯示，春雷霉素單劑對潰瘍病菌的抑菌率略低于乙蒜素及春雷霉素，為69.34%。因此，總體而言，本研究的單劑抑菌結(jié)果與前人研究一致。

在防治獼猴桃潰瘍病的混配藥劑開發(fā)方面，周艷麗[17]及曲子瑞[18]發(fā)現(xiàn)，乙蒜素與三唑類、壬菌銅或吡唑醚菌酯混用，防治效果可提高40%～75%。王瑞等[19]研究認為，乙蒜素與溴硝醇1∶5 比例、乙蒜素與代森錳鋅1∶3 比例混配，具有較強的增效作用。張毅等[20]證實，病斑刮除后，運用四霉素和噻霉酮混配液進行傷口涂抹具有較好的防治效果。楊貴琴等[21]研究發(fā)現(xiàn)，四霉素與噻霉酮5∶1 比例及四霉素與戊唑醇2∶1 比例混配時，對潰瘍病抑菌效果明顯。郭成[22]及強遙[23]認為，四霉素與大部分藥劑混用對潰瘍病菌均有增效或加和作用，田間防治效果理想，包括四霉素和乙蒜素1∶1、2∶1 和1∶2 配比。涂美艷等[24]通過田間試驗證實，在采果前20 d、采果后7～10 d 以及萌芽期，噴施2%春雷霉素300倍＋43%戊唑醇、0.15%四霉素1 200倍＋80%代森錳鋅800 倍等混配藥劑，可顯著降低紅陽獼猴桃潰瘍病的病情指數(shù)。

與上述前期研究結(jié)果基本一致，本文對13 種藥劑中室內(nèi)抑菌效果排名前7 位的藥劑進行了1∶1二元混配，制成21 種藥劑組合，初步確定了部分藥劑混配可提高對潰瘍病的抑菌率。如：將乙蒜素與代森銨、銅大師、四霉素、春雷霉素、可殺得3000進行混配后抑菌率均有所提高；四霉素與可殺得3000、乙蒜素及春雷霉素進行二元混配后，抑菌率從85.64%提高至92.49%以上；春雷霉素與乙蒜素、四霉素分別進行二元混配后抑菌率得到了顯著提高，從69.34%分別增至93.41%、92.49%。由此進一步證實，針對獼猴桃潰瘍病，開發(fā)混配防治藥劑這一方向是可行的，適當?shù)霓r(nóng)藥混配組合可顯著提高對潰瘍病菌的抑菌率及防效，符合國家提出的農(nóng)藥減施增效政策。

此外，本試驗進一步發(fā)現(xiàn)，4 種不同體積比例的乙蒜素、春雷霉素及四霉素混配均具有顯著的增效作用，其中1∶1∶2 的混配組合對潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌率達到99.14%，且共毒系數(shù)達到247.567 0，較前期復配研究[17-24]及本研究中二元復配組合的抑菌效率明顯提高。另外，乙蒜素、春雷霉素及四霉素均為植物或微生物的提取或代謝產(chǎn)物，相較于其他藥劑混配而言，更不易產(chǎn)生抗藥性，具有安全、綠色及環(huán)保的特點，應(yīng)用前景廣闊。2021 年，通過在6 個省30 個地區(qū)進行小范圍田間防治試驗，本研究團隊已初步確定了該混配藥劑的高效性、安全性及穩(wěn)定性，并證實了在冬季清園后及早春萌芽前進行刷干涂抹的防治效果明顯，優(yōu)于稀釋后噴霧。下一步將在陜西、四川、貴州及河南等獼猴桃主產(chǎn)區(qū)進行更大范圍的田間試驗，通過一系列正交試驗進一步確定該混配藥劑的年使用次數(shù)、用量、最佳噴施時期及施用方式，以期使該混配藥劑達到最佳防效，為獼猴桃潰瘍病的減施增效、高效防治提供理論依據(jù)。