鎘脅迫對絹毛委陵菜-叢枝菌根真菌共生體根系結(jié)構(gòu)和生理的影響

高 冰 高鵬飛 范衛(wèi)芳 馮鄭紅 吳建慧

（東北林業(yè)大學園林學院，哈爾濱 150040）

絹毛委陵菜（）是薔薇科（Ro?saceae）委陵菜屬（），多年生草本植物，是一種良好的園林地被植物，易于繁殖管理，具有較強的抗寒性、抗旱性。近年來，重金屬如鎘對土壤造成的污染成為一個世界性難題，當重金屬污染環(huán)境后，會隨著食物鏈進入各生物體中，造成重金屬在生物體內(nèi)的富集。據(jù)調(diào)查，我國北京西郊污水灌溉區(qū)表層土壤的含鎘量已達到0.53 mg·kg，是當?shù)乇镜字档?倍左右，每年由于土壤中含鎘濃度很高，造成荒廢的土地面積日漸增加，因此，鎘污染的土地治理日趨重要。

叢枝菌根（AM）真菌可以與大多數(shù)植物形成真菌-植物共生體結(jié)構(gòu)，在植物-環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，能促進宿主植物的生長發(fā)育，也可以提高植物的對鎘的耐受性。利用AM 真菌與植物形成共生體系的方法對重金屬污染土地進行治理已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。

以往對接種AM 真菌的植物抗鎘性主要為研究與植物互利共生的真菌類型、調(diào)查接種后侵染率高低、接種后植物生長量的變化等。通過前期侵染率試驗發(fā)現(xiàn)絹毛委陵菜接種摩西球囊霉（）侵染率極高，因此本研究以接種摩西球囊霉后的絹毛委陵菜為試驗材料，通過根系超微結(jié)構(gòu)觀察、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理生化指標測定，進一步從生理生化層面上揭示絹毛委陵菜-叢枝菌根共生系統(tǒng)對鎘的響應(yīng)機制，為利用共生體技術(shù)提高絹毛委陵菜的抗鎘性能，恢復(fù)和改良鎘污染土壤提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

于2020年從東北林業(yè)大學苗圃實驗站將株高為4～5 cm的絹毛委陵菜取回。從北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所及石河子大學綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室購回摩西球囊霉和根內(nèi)根生囊霉（）兩種真菌接種物，包含菌根片段、真菌菌絲和真菌孢子等，孢子量約為20 個·g。CdCl·2.5HO 溶液購買于溫州雨澤科技有限公司。泥炭土、珍珠巖、蛭石、腐殖酸等購于黑龍江省哈爾濱市花卉市場。

1.2試驗方法

選取健康、株高、長勢一致的幼苗放入清水中緩苗3～5 d 后，注意觀察幼苗長勢，待幼苗生長正常，剪掉多余老根，剩余一部分新根。

AM 真菌接種處理：將購回的泥炭∶珍珠巖∶蛭石按4∶1∶1的體積比進行混合攪拌至均勻，置于高壓滅菌鍋中，120 ℃、240 kPa 滅菌4 h，以消除其他真菌孢子的影響，將經(jīng)過高溫高壓滅菌的基質(zhì)土均勻放置在花盆中（口徑18 cm），精確稱取、2 種叢枝真菌接種物25 g 均勻置于2 cm 表層基質(zhì)，未接種的則將滅菌后的2 種接種物均勻置于2 cm 表層基質(zhì)，確保植物生長基質(zhì)一致。鎘處理：每盆基質(zhì)干重700 g，鎘添加以CdCl·2.5HO 水溶液的形式與基質(zhì)土進行充分混合，不添加鎘的則用蒸餾水澆灌作為對照。

將一致的幼苗移至接菌的基質(zhì)土中，植物生長35 d 內(nèi)，每周需補充1/4 倍的霍格蘭營養(yǎng)液40～50 mL，從36 d 開始每周補充相同營養(yǎng)液90～100 mL，從發(fā)芽開始起第80 天，即開始進行鎘溶液脅迫處理，處理周期為10 d。采取雙因素析因試驗設(shè)計，試驗因素為鎘和AM 真菌。設(shè)置5 個Cd 濃度處理：Cd0（0 mg?L）、Cd5（5 mg?L）、Cd10（10 mg?L）、Cd15（15 mg?L）、Cd20（20 mg?L），AM真菌包括3 個水平，分別為：不接種、接種、接種，共15 組處理，每組處理3盆，每組3次重復(fù)。

1.2.2 菌根侵染率的測定

從不同基質(zhì)中挖出絹毛委陵菜后，用清水輕輕沖洗根部，將根部附帶的雜質(zhì)等沖洗干凈至根部呈黃白色，注意控制水流速度和人為操作手法，以免破環(huán)根系。根系清洗干凈后，取新鮮根樣，精確剪取1 cm 不同粗細的根段保存于FAA 固定液（90 mL 70%乙醇+5 mL 冰醋酸+5 mL 38%甲醛）中，標記后可放入冰箱內(nèi)4℃密封保存。接種、的絹毛委陵菜各剪取長度約1 cm 的根段100 個，用10%氫氧化鉀溶液在90 ℃水浴鍋消解60 min 至透明狀，用蒸餾水清洗兩遍，再用2%的鹽酸酸化至少30 min后用蒸餾水清洗2遍，用HO和蒸餾水再各清洗2 遍，用Trypan blue進行染色，乳酸甘油溶液進行脫色處理后制片，按照劉潤進等方法測定菌根侵染率。

將接菌成功的絹毛委陵菜根系根尖1 cm左右的長度剪下，取材尺寸為3 mm，再按照張靜對電鏡觀察植物根系超微結(jié)構(gòu)樣品的制備方法進行制片，最后用H7650透射電鏡進行觀察。

超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量均以絹毛委陵菜葉片為材料并運用比色法進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

菌根侵染率采用MYCOCALC 軟件計算。利用SPSS 22.0 軟件對超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量進行Duncan’s 單因素方差多重比較分析，差異顯著水平為0.05。

根系超微結(jié)構(gòu)使用Photoshop 軟件進行對圖片的處理加工，用Excel 軟件對所有數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 22.0軟件進行方差差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1絹毛委陵菜根系菌根共生的結(jié)構(gòu)特征

絹毛委陵菜被摩西球囊霉侵染后，經(jīng)觀察鑒定為Paris（P）型菌根結(jié)構(gòu)（見圖1）。侵染絹毛委陵菜的根系，首先形成附著泡和侵入點結(jié)構(gòu)，隨后有菌絲進入絹毛委陵菜根內(nèi)（見圖1：a～c），菌絲形態(tài)彎曲纏繞、較粗壯，可在表層細胞間直接傳播（見圖1：a～e），形成數(shù)量很少的胞間和胞內(nèi)連絲（見圖1：b～g），其中一部分根內(nèi)菌絲與根外菌絲真菌結(jié)構(gòu)相連（見圖1：c～h），剩余菌絲頂端膨大形成泡囊（vesicles）。菌絲形成叢枝結(jié)構(gòu)的數(shù)量較少，往往更多的集中于中柱的幾層內(nèi)表皮細胞之間（見圖1：g～h）。細胞內(nèi)泡囊數(shù)量不多，泡囊形態(tài)多為橢圓形，也有圓形、長橢圓形等等，有的泡囊內(nèi)有油狀物（見圖1：b～c，h～i）。

圖1 絹毛委陵菜根根系菌根共生顯微結(jié)構(gòu)a.無隔菌絲侵入根系成分枝狀H（hypha）；b.無隔菌絲H 及泡囊V（vesicle）；c.異形泡囊V；d.菌絲侵入點H；e.菌絲H 二叉狀及頂端膨大成泡囊V；f.已消解成斑點狀叢枝A（Arbuscular）及有隔菌絲H；g.菌絲侵入點H；h.叢枝A及圓形泡囊V；i.不規(guī)則泡囊VFig.1 Microstructure of symbiosis of roots and mycorrhiza of P.sericeaa.Non-septal hyphae invade root component dendritic H（hypha）；b.Non-septal hyphae H and vesicles V（vesicle）；c.Abnormal vesicles V；d.Hypha invasion points H；e.Mycelium H has a bifurcated shape and swells at the top to form a vesicle V；f.It has been digested into a spotted arbuscular A（Arbuscular）and a septal hyphae H；g.Mycelial invasion point H；h.Witch branch A and round vesicle V；i.Irregular vesicle

2.2絹毛委陵菜根系A(chǔ)M真菌侵染狀況

從表1 可以看出，菌根類型均為P 型，在鎘質(zhì)量濃度為0 mg?L、不接菌的對照處理中，未發(fā)現(xiàn)有菌根真菌的侵染，即侵染率為0。在鎘質(zhì)量濃度為0 mg?L、接種的絹毛委陵菜菌根侵染率極高，達到100%，接種的絹毛委陵菜菌根侵染率為89.33%。對于接種的處理組，隨著土壤基質(zhì)施鎘的濃度由5、10、15、20 mg?L逐漸升高，絹毛委陵菜根系的菌根侵染率表現(xiàn)為逐漸下降，這表明土壤中的叢枝菌根真菌生長受到重金屬鎘的抑制作用。對于接種的處理組，鎘質(zhì)量濃度水平逐漸提高，根系的菌根侵染率表現(xiàn)為明顯下降。

表1 鎘脅迫下AM真菌對絹毛委陵菜菌根侵染率的影響Table 1 Effect of AM fungi on the infection rate of P.sericea mycorrhiza under cadmium stress

2.3接種摩西球囊霉真菌的絹毛委陵菜超微結(jié)構(gòu)

由表1可見，在鎘脅迫處理下，接種處理的絹毛委陵菜侵染率高于接種處理，因此對接種的植物進行超微結(jié)構(gòu)觀察。在鎘脅迫下，絹毛委陵菜的細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生各種變化，植物體內(nèi)的細胞器數(shù)量及每個細胞的大小隨著鎘質(zhì)量濃度的變化而發(fā)生變化。植物體內(nèi)細胞質(zhì)中的線粒體對重金屬鎘較為敏感，隨著鎘質(zhì)量濃度的變化，線粒體的大小和數(shù)量也在變化。植物細胞器線粒體結(jié)構(gòu)呈封閉的囊狀，有兩層細胞膜，主要是由內(nèi)、外膜、膜間隙及基質(zhì)構(gòu)成，內(nèi)膜向內(nèi)褶疊成嵴，在透射電鏡下，觀察到絹毛委陵菜的細胞壁會隨著生長期所受外界條件影響而呈現(xiàn)薄厚的轉(zhuǎn)變，同時細胞內(nèi)的淀粉粒也是隨鎘脅迫程度的變化而變化的指標之一。

植物正常生長（鎘質(zhì)量濃度為0 mg?L、不接菌）的狀況下（見圖2a），絹毛委陵菜根系細胞結(jié)構(gòu)整體正常且完整，細胞壁輪廓完整，厚度合適；線粒體大小正常，數(shù)量較多，且多為圓形或橢圓形，在細胞內(nèi)分布廣泛；有少量的淀粉粒貼著細胞壁存在，各個淀粉粒的體積較?。灰号蒹w積較大，所占整個細胞的比例也較大。

對于不接菌的絹毛委陵菜，在鎘質(zhì)量濃度為5 mg?L的輕度脅迫（見圖2b）下，線粒體數(shù)量和大小與正常生長情況下幾乎相同；不同的是，細胞壁開始變??；而線粒體數(shù)量減少、體積變小、在細胞內(nèi)分布范圍變大；同時液泡的體積及所占比例變小。在鎘質(zhì)量濃度為10 mg?L中度脅迫下（見圖2c），細胞壁的厚度與輕度脅迫下的厚度相比更?。痪€粒體的數(shù)量大幅減少；淀粉粒的體積變大，且分布在細胞的各個部分。在鎘質(zhì)量濃度為20 mg?L重度脅迫下，和之前脅迫相比，細胞壁出現(xiàn)大面積破損現(xiàn)象；細胞內(nèi)器官和物質(zhì)完全被破壞，已分辨不出細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)（見圖2d）。

對于接種摩西球囊霉真菌的絹毛委陵菜，在鎘質(zhì)量濃度為5 mg?L輕度脅迫下（見圖2e），線粒體大小較正常生長情況下和同鎘質(zhì)量濃度不接菌情況下偏大，而細胞壁的厚度與之前處理變化一致；淀粉粒數(shù)量增多且分布范圍變廣，液泡所占比例較大。在鎘質(zhì)量濃度為10 mg?L脅迫下（見圖2f）與正常狀況下相比細胞壁變薄，但是與同等鎘質(zhì)量濃度、不接菌的情況相比，線粒體小幅減少；淀粉粒分布在細胞各處。在鎘質(zhì)量濃度為20 mg?L重度脅迫下，細胞壁出現(xiàn)破損現(xiàn)象，但與同等鎘質(zhì)量濃度、不接菌情況下相比，未完全破損，仍可見細胞的整體輪廓；細胞內(nèi)無完整細胞器或組織，但有可見的淀粉粒存在于細胞中且分布分散（見圖2g）。

圖2 絹毛委陵菜根系超微結(jié)構(gòu)a.不接菌、Cd0（×20 000）；b.不接菌、Cd5（×20 000）；c.不接菌、Cd10（×20 000）；d.不接菌、Cd20（×20 000）；e.接菌、Cd5（×20 000）；f.接菌、Cd10（×20 000）；g.接菌、Cd20（×20 000）；M.線粒體；W.細胞壁；S.淀粉粒；V.液泡Fig.2 The ultrastructure of the root system of P.sericeaa.No inoculation，Cd0（×20 000）；b.No inoculation，Cd5（×20 000）；c.No inoculation，Cd10（×20 000）；d.No inoculation，Cd20（×20 000）；E.Inocu?lation，Cd5（×20 000）；f.Inoculation，Cd10（×20 000）；g.Inoculation，Cd20（×20 000）；M.Mitochondria；W.Cell wall；S.Starch granules；V.Vacuoles

2.4鎘脅迫對絹毛委陵菜-摩西球囊霉共生體各指標的影響

絹毛委陵菜用不同濃度的Cd 脅迫處理10 d后，生長狀態(tài)如圖3 所示。如圖3a～e 和a1～e1 所示，不接菌的絹毛委陵菜在Cd10 處理下出現(xiàn)葉片邊緣泛黃、少許莖出現(xiàn)彎曲狀生長；在處理為Cd15時，葉片邊緣卷曲泛黃并出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象、莖彎曲明顯；當Cd 濃度達到20 mg?L時，植物已基本無法直立生長，葉子發(fā)黃并出現(xiàn)大面積萎蔫。從圖3：f～j 和f1～j1 中看出，接種處理的絹毛委陵菜在Cd10 處理下仍正常生長，葉片未出現(xiàn)變化；在Cd15 處理下，葉片邊緣呈現(xiàn)卷曲和泛黃現(xiàn)象，莖開始彎曲生長；在處理為Cd20 時，絹毛委陵菜較不接菌植株的生長狀態(tài)更好，葉子發(fā)黃程度較輕且少部分葉片出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。

圖3 鎘脅迫下絹毛委陵菜-摩西球囊霉共生體的生長指標a，a1.不接菌、Cd0；b，b1.不接菌、Cd5；c，c1.不接菌、Cd10；d，d1.不接菌、Cd15；e，e1.不接菌、Cd20；f，f1.接菌、Cd0；g，g1.接菌、Cd5；h，h1.接菌、Cd10；i，i1.接菌、Cd15；j，j1.接菌、Cd20Fig.3 Growth index of Potentilla sericea L.-F.mosseae symbiont under cadmium stressa，a1.No inoculation，Cd0；b，b1.No inoculation，Cd5；c，c1.No inoculation，Cd10；d，d1.No inoculation，Cd15；e，e1.No inoculation，Cd20；f，f1.Inoc?ulation，Cd0；g，g1.Inoculation，Cd5；h，h1.Inoculation，Cd10；i，i1.Inoculation，Cd15；j，j1.Inoculation，Cd20

從圖4A 中可以看出，SOD 活性整體隨著鎘質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，Cd0 至Cd10 明顯上升（<0.05），Cd10 至Cd15 明顯下降（<0.05）。對于不接菌的絹毛委陵菜，在Cd0處理下，SOD 活性為188.6 U?g，當Cd10 處理時，SOD活性達到峰值為340.8 U?g，然后鎘質(zhì)量濃度繼續(xù)增加到20 mg?L，SOD 活性降到110.9 U?g；對于接種的絹毛委陵菜SOD 活性仍然是隨著鎘質(zhì)量濃度的增加呈先升后降的趨勢，但不同點在于，當Cd0處理時，SOD 活性為206.3 U?g，當鎘質(zhì)量濃度升高為5、10 mg?L時，SOD 活性逐漸達到更高的峰值為391.0 U?g，然后隨著鎘質(zhì)量濃度逐漸增加，SOD活性最終降至150.7 U?g。

從圖4B 中可以看出，可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鎘脅迫濃度增大和時間延長，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，Cd0 至Cd5 明顯下降（<0.05），Cd10至Cd15下降不明顯（>0.05）。對于不接菌處理的絹毛委陵菜，隨著鎘質(zhì)量濃度依次從0 mg?L增加到20 mg?L，可溶性蛋白含量從7.05 mg?g降至0.89 mg?g（<0.05）；對于接菌處理的絹毛委陵菜，可溶性蛋白含量從8.55 mg?g降至1.21 mg?g（<0.05）。

從圖4C 中可以看出，葉綠素含量整體呈下降趨勢，Cd0 至Cd10 明顯下降（<0.05），Cd10 至Cd15下降不明顯（>0.05）。對于不接菌的絹毛委陵菜，葉綠素含量在Cd=0 mg?L處理時最高為6.12 mg·kg，當Cd=20 mg?L時最低為0.89 mg?kg；對于接種摩西球囊霉真菌的絹毛委陵菜在Cd=0 mg?L處理時最高為7.59 mg?kg，當Cd=20 mg?L處理時最低為1.21 mg?kg。

圖4 鎘脅迫下絹毛委陵菜-摩西球囊霉共生體的生理指標Fig.4 Physiological indicators of P.sericea-F.mosseae symbiont under cadmium stress

從圖4D 中可以看出，脯氨酸含量整體呈先升后降 的趨 勢，Cd0 至Cd5 明 顯上 升（<0.05），Cd15～Cd20 處理下植物受損傷嚴重，生理機能已出現(xiàn)問題。在不接菌處理時，脯氨酸含量在Cd10處理時達到峰值為4 750 μg?g，而接種的植物在Cd10處理時達到的峰值為5 569 μg?g。從圖4E 中可以看出，MDA 含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，Cd5 至Cd10 明顯上升（<0.05），Cd10 至Cd15 上升不明顯（>0.05）。對于不接菌的絹毛委陵菜，MDA 含量在Cd0 處理時最低為8.56 μmol?g，當Cd20處理時最高為10.20 μmol?g；對于接種摩西球囊霉真菌的絹毛委陵菜在Cd0 處理時 最低 為9.32 μmol?g，當Cd20 處理 時最 高為11.23 μmol?g。

3 討論

隨著土壤重金屬污染問題日趨嚴重，植物與微生物共生修復(fù)污染土壤已成為生物修復(fù)研究熱點，具有巨大發(fā)展前景，接種不同的AM 真菌能夠改變宿主植物耐受重金屬的能力。相關(guān)研究表明，當Cd 進入根內(nèi)，細胞內(nèi)的氧化還原平衡遭到破壞，產(chǎn)生活性氧基團，AM 真菌能刺激植物激活自身的防御機制來抵御重金屬的危害，通過提高植物體內(nèi)一些抗氧化物酶的活性，達到清除自由基、避免對細胞造成傷害的目的，例如植物葉片超氧化物歧化酶等活性升高。本研究中，在鎘脅迫下接種AM真菌，摩西球囊霉對絹毛委陵菜侵染率高達100%，根內(nèi)根生囊霉侵染率可達到89.33%，這與高璿濛等的研究結(jié)果類似。

通過透射電鏡可以清楚觀察到絹毛委陵菜的根系結(jié)構(gòu)，顯示根系細胞組織和細胞的微細結(jié)構(gòu)，以及細胞內(nèi)各物質(zhì)的形態(tài)大小等。本試驗主要對絹毛委陵菜接種AM 真菌再對植物根系細胞進行觀察，結(jié)果表明，在鎘脅迫下，接種真菌可以激活絹毛委陵菜自身防御機制來提高植物抗性，在植物根系主要表現(xiàn)在細胞膜、細胞壁、液泡、線粒體等組織及器官上，均減輕了同等鎘脅迫下不接菌植物所受的損傷。當植物受重金屬脅迫后，其細胞超微結(jié)構(gòu)改變是植物一系列生理活動異常的細胞學基礎(chǔ)，因此研究植物受重金屬毒害后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，在今后的研究中對揭示重金屬毒害植物的機理有著重要意義。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)存在一些重要的保護酶，超氧化物歧化酶的活性與植物抗性密切相關(guān)，當受到鎘脅迫時，植物體內(nèi)的酶會產(chǎn)生應(yīng)急機制，提高相關(guān)酶的活性，在低濃度脅迫時可以降低重金屬對植物造成的傷害。除此之外，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量、葉綠素含量、丙二醛、脯氨酸含量也可以反映植物受到迫害的程度。本研究在低濃度鎘下處理絹毛委陵菜，植物體內(nèi)酶活性會有所提高，植物抗性增強，接種后，與不接菌相比，酶活性和脯氨酸含量顯著上升，植物體內(nèi)的抗性系統(tǒng)顯著提高，植物受到的鎘脅迫超出特定范圍后，酶活性和脯氨酸含量才開始下降。對于可溶性蛋白和葉綠素含量，接菌后植物體內(nèi)的含量下降相較于不接種處理的植物較慢，在一定程度上減輕鎘對植物的傷害。對于丙二醛含量，接菌后植物體內(nèi)的含量緩慢上升，最低值和峰值均低于不接種的絹毛委陵菜，說明當植物受到鎘脅迫時，接菌成功的植物抗性更強。

4 結(jié)論

（1）接種的植物菌根侵染率高達100%，而接種的絹毛委陵菜侵染率達89%，并且用鎘處理植物后，隨著鎘質(zhì)量濃度的升高，侵染率降低，表明重金屬鎘對土壤中叢枝菌根真菌具有抑制作用。

（2）用鎘溶液處理不接種摩西球囊霉的絹毛委陵菜，隨著鎘濃度升高，植物細胞壁變薄直至破損、液泡變小至破損消失、淀粉粒增多且范圍分布廣。與摩西球囊霉共生的絹毛委陵菜用鎘溶液處理后，當鎘質(zhì)量濃度低時細胞壁輕微變薄、液泡變小并不明顯，當濃度達10 mg?L時，細胞壁出現(xiàn)小范圍破裂和液泡變小的趨勢，高濃度（20 mg?L）鎘時，植物細胞壁破裂進而失去細胞原有形態(tài)。

（3）在鎘脅迫下，接種摩西球囊霉真菌的絹毛委陵菜的生長狀態(tài)和各生理指標與不接菌相比，變化趨勢明顯。與不接菌相比，在植物抗鎘性方面有所提高，植物體抗性增強。

綜上所述，摩西球囊霉真菌比根內(nèi)根生囊霉真菌的侵染率高，接種摩西球囊霉的絹毛委陵菜在一定程度上提高了對鎘的抗性，緩解了鎘對植物的毒害。