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    山東地區(qū)鴨冠狀病毒流行病學(xué)調(diào)查*

    2022-08-04 07:39:04李琦劉鵬許薔田野呂俊峰
    家禽科學(xué) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:管中養(yǎng)鴨離心管

    李琦,劉鵬,許薔,田野,呂俊峰

    (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,山東 濟南 250100)

    冠 狀 病 毒(Coronaviruses,CoV)于1937年被發(fā)現(xiàn),分類上屬套式病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)。冠狀病毒又分為4個屬,分別為α、β、γ和δ,各種屬感染的宿主范圍差異較大,其中,γ屬冠狀病毒主要感染雞、鴨、鵝等禽類。鴨冠狀病毒是由陳貴錢等在2012年發(fā)現(xiàn),隨后的流行病學(xué)調(diào)查顯示該病原在鴨群中的感染率約為5%。山東省是我國養(yǎng)鴨最多的省份,僅2020年肉鴨出欄量就高達22億只,占全國肉鴨養(yǎng)殖的近40%,鴨產(chǎn)品出口占全國的70%以上。為了調(diào)查鴨冠狀病毒(Duck Coronaviruses, DCoV)的流行情況,本研究從山東各地的養(yǎng)鴨場采集樣品451份,用PCR方法進行檢測,并對所測毒株進行遺傳演化分析。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    從山東各地種鴨、蛋鴨、肉鴨養(yǎng)殖場采集樣品,樣品種類包括死胚、弱雛、腸組織、棉拭子。樣品具體來源及數(shù)量見表1。

    表1 樣品采集信息

    1.2 主要試劑和引物

    RNA提取試劑盒,購自杭州Axygen科技有限公司;One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    根據(jù)GenBank中的鴨冠狀病毒序列(GenBank號:JF699752)設(shè)計引物,選取病毒1b2區(qū)域,使用Primer 5軟件設(shè)計,上游引物為5′- GGTGGTAGTTTGTATGTGAA-3′,下游引物為5′-GGATACCGCTTATAACACT-3′,擴增片段長度為764 bp。引物由擎科生物科技有限公司(青島)合成。

    2 方法

    2.1 樣品處理

    將死胚和弱雛解剖,取直腸,與腸組織樣品進行相同處理。取直腸/腸組織樣品0.2 g于離心管中,加入1 mL生理鹽水和適量研磨珠,用組織研磨器充分研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至新的離心管,12 000 rpm離心5 min,取上清200 μL用于RNA提取。

    將棉拭子樣品放入離心管中,加入500 μL生理鹽水,用振蕩器振蕩。將震蕩后液體轉(zhuǎn)移至新的離心管,12 000 rpm離心5 min,取200 μL用于RNA提取。

    2.2 RNA提取

    用RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作如下:將200 μL轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入200 μL Buffer V-L,振蕩混勻,靜置5 min;加75 μL Buffer V-N,渦旋混勻,12 000 rpm離心5 min;將上清轉(zhuǎn)移至2 mL離心管,加300 μL異丙醇,混勻后轉(zhuǎn)移至制備管中,6 000 rpm離心1 min;棄濾液,加500 μL Buffer W1A(預(yù)先加入無水乙醇)至制備管中,室溫靜置1 min,12 000 rpm離心1 min;棄濾液,加800 μL Buffer W2至制備管中,12 000 rpm離心1 min;將制備管轉(zhuǎn)移至新的EP管中,加40 μL Buffer TE,室溫靜置1 min,12 000 rpm離心1 min,保存洗脫液。

    2.3 PCR檢測

    以RNA為模板,用One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒進行PCR檢測。反應(yīng)體系為20 μL,包括RNA 3 μL、上、下游引物各1 μL、2×Reaction Mix 10 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、RNase-free Water 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序為:45 ℃,30 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次;72 ℃ 5 min。

    反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測,出現(xiàn)條帶的PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司(青島)測序。

    2.4 序列分析

    從GenBank中選取禽冠狀病毒序列,用DNA Star軟件進行同源性分析,用Mega6軟件構(gòu)建進化樹。選取序列包括火雞冠狀病毒TCoV/IN-517/94株(GenBank號:GQ427175)和MG10株(EU095850),雞傳染性支氣管炎病 毒M41/Y191株(MW222181)、M41/Y83株(MW419300)以及疫苗株H52(AF352315和H120株(ON350836),鴨冠狀病毒DK2012-CoV株(KC869937)、DK/GD/27/2014(NC048214)、禽源冠狀病毒D2328/15/3/13/GH株(MZ325298)、D2334/11/2/13/CI株(MZ325299)。

    3 結(jié)果

    3.1 引物檢測結(jié)果

    設(shè)計特異性引物擴增鴨冠狀病毒1b2基因片段,以陽性樣品進行測試,結(jié)果顯示,能夠擴增出與目的條帶大小相似的片段(764 bp)(圖1),表明所設(shè)計的引物能夠用于臨床樣品的檢測。

    圖1 DCoV 陽性樣品檢測

    3.2 臨床樣品檢測結(jié)果

    用PCR方法對采集的451份樣品進行檢測,僅從濟寧(2份)和濰坊(1份)送檢樣品中檢測出鴨冠狀病毒,總陽性率為0.67%,其中濟寧地區(qū)的樣品陽性率為18.2%(2/11),濰坊地區(qū)的樣品陽性率為3.3%(1/30)。

    3.3 冠狀病毒序列分析結(jié)果

    將PCR擴增到的3個片段進行測序,分別命名為DCoV WF 01株(濰坊送檢樣品測出)以及DCoV JN 01和02株(濟寧送檢樣品測出),并與GenBank中已公布的部分冠狀病毒的1b2基因序列進行遺傳演化分析,結(jié)果顯示:DCoV WF 01株、DCoV JN 01株和DCoV JN 02株位于同一分支,具有更近的遺傳演化關(guān)系,但與其它毒株并不位于同一分支,遺傳演化關(guān)系差異明顯(圖2)。

    圖2 冠狀病毒1b2基因核苷酸序列的遺傳演化分析

    4 討論與結(jié)論

    鴨冠狀病毒是對養(yǎng)鴨業(yè)危害較為嚴(yán)重的病原之一,掌握其在鴨群中的流行趨勢對于防控該病原具有重要意義。山東作為主要的鴨養(yǎng)殖大省,更需要對流行病的預(yù)防和控制及時采取措施。本研究從山東各地區(qū)鴨場采集樣品,用PCR方法進行檢測,旨在調(diào)查了解山東養(yǎng)鴨地區(qū)冠狀病毒的流行情況。與之前報道的冠狀病毒感染率不同,本研究所測的總體陽性率僅為0.67%,證明目前山東地區(qū)鴨場養(yǎng)殖管理水平較高,疫病的防控措施較為嚴(yán)格。結(jié)合近年來新冠肺炎疫情的存在,人員流動頻率降低以及人們對疫情防控的重視提高,也為動物疫病的減少提供了條件。

    早期的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,鴨冠狀病毒具有發(fā)病率高、陽性率高、呈地方性流行的特點。在本次樣品采集過程中,陽性樣品采集地區(qū)(濟寧和濰坊)并未出現(xiàn)冠狀病毒相關(guān)疾病,據(jù)此我們推測冠狀病毒可能發(fā)生變異。我們發(fā)現(xiàn),分析測出的冠狀病毒的1b2基因序列,與之前發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒相比,遺傳演化關(guān)系較遠。但是,鴨冠狀病毒的致病性和傳播特點是否發(fā)生改變,還需要后續(xù)試驗進行驗證。

    綜上所述,本研究對冠狀病毒在山東地區(qū)鴨群中的流行情況進行了調(diào)查,研究結(jié)果能夠為該病防控策略的調(diào)整提供數(shù)據(jù)支持。

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