心肌細(xì)胞特異性Snhg5過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和應(yīng)用*

孔靜祎 徐京平 劉瀾濤 王添樂 侯 寧 李振華 楊 曉 王 劍

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，北京 102206)

近年來，隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，國(guó)民生活方式的變化，尤其是人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速，心血管病患病率和死亡率處于持續(xù)上升階段。目前，中國(guó)心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村為46.66%，城市為43.81%，心血管病給居民和社會(huì)帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日漸加重。心臟重塑是多種心血管疾病(如高血壓、心肌缺血、心律失常等)的共同病理過程，隨著心臟重塑的進(jìn)展，心力衰歇和心源性猝死發(fā)生率顯著提高。因此，闡明心臟重塑的發(fā)生機(jī)制，尋找調(diào)節(jié)心臟重塑發(fā)生的新型調(diào)控分子對(duì)于防治心力衰竭以及改進(jìn)心臟疾病個(gè)性化治療策略具有重要和積極的意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子[1]。近年來的研究表明LncRNA在心臟發(fā)育和病理重塑過程中發(fā)揮著非常重要的作用。如，小鼠心臟相關(guān)LncRNA AK143260(braveheart，Bvht)通過控制心臟細(xì)胞分化調(diào)節(jié)基因中胚層后螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(mesoderm posterior 1，MesP1)，Bvht通過激活參與心臟中胚層向各類心臟前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因網(wǎng)絡(luò)，來刺激干細(xì)胞分化為特定的心臟細(xì)胞[2-3]。肌球蛋白重鏈相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄本(myosin heavy chain associated RNA transcripts，Mhrt)在心臟組織中特異性表達(dá)，功能研究顯示其可以抑制病理性心肌肥厚的發(fā)生[4]。另一種在心臟組織中豐度較高的心肌肥厚相關(guān)表觀遺傳調(diào)節(jié)因子(cardiac-hypertrophy-associated epigenetic regulator，Chaer)，能通過與多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycomb repressor complex 2，PRC2)復(fù)合體內(nèi)的Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相互作用，在心肌肥厚的發(fā)生及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的過程中發(fā)揮重要的功能[5]。此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19能夠抑制心肌細(xì)胞的肥大生長(zhǎng)，在心臟組織中過表達(dá)H19能夠緩解病理性心室重塑[6-7]。Snhg5(small nucleolar RNA host gene 5)，又稱U50HG, 是非蛋白編碼小核RNA (SnoRNA)宿主基因家族和5′-寡嘧啶家族基因的一個(gè)成員，近年來的研究顯示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的功能。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)Snhg5在發(fā)生病理性心臟重塑的小鼠模型心臟樣品中表達(dá)水平上調(diào)，提示其在心臟重塑發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要功能，但目前關(guān)于其在心臟組織的功能還未見報(bào)道。

為了研究Snhg5在心臟組織中發(fā)揮的功能，本研究建立了心肌細(xì)胞特異性Snhg5過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠的成功建立將首次提供體內(nèi)的遺傳學(xué)證據(jù)揭示Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮的功能，并也有可能為未來探索心臟重塑發(fā)生機(jī)制，及發(fā)展心臟疾病的治療策略提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與菌株：α-MHC-Cre-hGH載體由本室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只SPF級(jí)FVB小鼠，體質(zhì)量25～28 g，來源于維通利華公司【SCXK(京)2021-0011】。本實(shí)驗(yàn)按照生命組學(xué)研究所國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理委員會(huì)審批號(hào)：IACUC-20200515-17MB。

1.1.3工具酶和試劑：所用的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、mRNA Selective PCR Kit (AMW)Ver 1.1均購自TaKaRa(大連)公司，蛋白酶K購自Merck公司。試劑盒QIA prep Spin Miniprep Kit購自Qiagen公司，瓊脂糖為Biowest Agarose瓊脂糖，核酸染料(EL105)購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。蘇木素(HHS16)購自Sigma公司。0.1 mol/L檸檬酸鹽修復(fù)液(ZLT9065)、雙氧水(PV-6001)、山羊血清工作液(ZLI-9056)、一抗稀釋液(ZLI-9020)、兔二步法試劑盒(PV6002)購自北京中杉金橋有限公司。TSA Systems相關(guān)顯色試劑購自PerkinElmer公司。Trizol購自Invitrogen公司。Real-time PCR Mix(QPK-201)購自TOYOBO公司。

1.2 方法

1.2.1心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)Snhg5 (α-MHC-Snhg5-hGH)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：以小鼠心臟組織cDNA為模板擴(kuò)增獲得小鼠Snhg5，引物為：MHC-Snhg5 1 s(5′-TTTGTCGACGGGCTCGTTCTTTTACG ACG-3′)和Snhg5 1a(5′-TTTAAGCTTTTTGCAA TTGAATGTTTTTTA-3′)，引物兩端分別引入了SalⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增體系：1 μL cDNA，25 μL 2 × buffer ，10 μL dNTPs，1 μL KOD酶，1 μL上游引物，1μL下游引物，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，回收1.1 kb左右的目的片段，克隆入T載體中，測(cè)序結(jié)果確認(rèn)序列準(zhǔn)確無誤無任何突變。將測(cè)序正確的Snhg5 片斷連入用SalⅠ和HindⅢ酶切的α-MHC-Cre-hGH載體，得到了含有α-MHC啟動(dòng)子、Snhg5基因以及人生長(zhǎng)素基因polyA共3個(gè)元件的α-MHC-Snhg5-hGH的轉(zhuǎn)基因載體。

1.2.2受精卵的顯微注射：將α-MHC-Snhg5-hGH的轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)KpnⅠ和SacⅡ酶切線性化后，通過受精卵原核顯微注射法[8]，共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內(nèi)進(jìn)行妊娠。實(shí)驗(yàn)用FVB小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2.3轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定：取出生后10 d左右的子代小鼠，剪下約0.5 cm的尾尖置于1.5 mL離心管中，加入400 μL組織裂解液，50 ℃保溫過夜，制備基因組DNA作為PCR的模板。αMHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因特異引物α-MHC-s和MHC-Snhg5-2a由擎科公司合成，其中MHC-1: 5’-ATGACA GACAGATCCCTCCTATCTCC-3’位于α-MHC啟動(dòng)了序列上，MHC-Snhg5b-2a位于Snhg5片段上，序列為5’-CGCCATTGTCCTTGTGAA-3’。可擴(kuò)增獲得300 bp的片段，用于陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系：20 μL體系：1μL小鼠DNA，10 μL 2 × mix ，7 μL ddH2O，1μL上游引物，1μL下游引物。PCR擴(kuò)增的條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.2.4Snhg5在不同組織中表達(dá)水平的檢測(cè)：提取心臟及其他組織RNA，將提取的RNA按 TOYOBO公司的ReverTra? Ace qPCR RT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)體系為：RNA 2 μg；5×RT Mix (TOYOBO) 2 μL；DEPC水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ ，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。

利用7500 Fast real-time PCR system對(duì)上述獲得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)。引物序列為：

GAPDH sense: 5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′；

GAPDH antisense: 5′-GGTCCTCAGTGTAGCCC AAG-3′；

Snhg5 sense: 5′-CAGTCCGCCTGTGAAGAT-3′；

Snhg5 antisense: 5′-CTGCCAGAATAAGGAAA TAG-3′；

擴(kuò)增條件為：95 ℃：20 s，95 ℃：60 s，95 ℃：15 s，60 ℃：15 s，72 ℃：45 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃：15 s； 60 ℃：60 s； 95 ℃：30 s； 60 ℃：15 s。

1.2.5小鼠心臟組織學(xué)檢測(cè)：取兩個(gè)月小鼠心臟組織于4% PFA固定過夜后，放入包埋機(jī)中進(jìn)行系列組織脫水和透蠟，包埋蠟塊。利用石蠟切片機(jī)制作厚度為5 μm的組織切片，用于H&E和Masson染色觀察心臟組織形態(tài)和纖維化改變情況，以及Laminin免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積改變[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graphpad進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05和P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性Snhg5轉(zhuǎn)基因載體(αMHC-Snhg5-hGh)

α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體主要含有3個(gè)元件：5.5 kb啟動(dòng)子片斷，1個(gè)1.1 kb的Snhg5基因和2.1 kb含有內(nèi)含子的人生長(zhǎng)激素(hGH)PolyA序列(圖1A)。對(duì)得到的載體進(jìn)行SalⅠ 和HindⅢ 酶切鑒定，顯示出現(xiàn)10.7 kb 和1.1 kb的片斷，其結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符(圖1B)。進(jìn)一步利用Snhg5全長(zhǎng)引物對(duì)載體進(jìn)行 PCR鑒定，轉(zhuǎn)基因載體出現(xiàn)1.1 kb條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1C)。

圖1 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建與鑒定注：A. α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)示意圖；B. 轉(zhuǎn)基因載體Sal Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切鑒定圖,1和10：DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),2～9：連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質(zhì)粒；C. 轉(zhuǎn)基因載體PCR鑒定圖,1和10：DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2～8:連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質(zhì)粒Fig.1 Construction and identification of α-MHC-Snhg5 transgenic vectorNote：A. Structure diagram of α-MHC-Snhg5 transgenic vector; B. Restriction map of transgenic vectors digested by Sal I and Hind Ⅲ,1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～9: α-MHC-Snhg5-hGh vectors; C. PCR identification map of transgenic vectors，1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～8： α-MHC-Snhg5-hGh vectors

2.2 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

利用KpnⅠ和SacⅡ 酶切去除原核載體序列，電泳回收8.7 kb的α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因片段。該片段純化后，用注射用TE稀釋至2.0 ng/μL。通過顯微注射，將該片段導(dǎo)入小鼠受精卵雄原核中。共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內(nèi)進(jìn)行妊娠，有3只假孕母鼠懷孕，獲得子代小鼠14只，陽性小鼠4只，陽性率28.6%。提取了子代小鼠的鼠尾DNA，利用α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因特異引物α-MHC-s和 MHC-Snhg5-2a進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因首建者小鼠出現(xiàn)300 bp的陽性條帶(圖2)。

圖2 小鼠基因型鑒定結(jié)果圖注：1和10：Mark Ⅰ DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物；2～4：轉(zhuǎn)基因首建小鼠；5～8：非轉(zhuǎn)基因小鼠作為陰性對(duì)照；9：轉(zhuǎn)基因載體作為陽性對(duì)照Fig.2 Results of mouse genotypingNote：1,10: Mark Ⅰ DNA relative molecular weight standard; 2～4: transgenic founder mice;5～8: non-transgenic mice; 9: Transgenic vector as positive control

2.3 α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中Snhg5表達(dá)水平的檢測(cè)

為檢測(cè)Snhg5過表達(dá)的組織特異性，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中Snhg5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示α-MHC-Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織中的Snhg5表達(dá)水平較對(duì)照小鼠心臟明顯升高(圖3A)，而其他組織內(nèi)Snhg5無過表達(dá)情況 (圖3B)，表明心肌細(xì)胞特異性過表達(dá)Snhg5的轉(zhuǎn)基因小鼠建立成功。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠心臟及其他組織中Snhg5表達(dá)水平的檢測(cè)注：A. 對(duì)照和轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織中Snhg5表達(dá)水平的檢測(cè)；B. 對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因小鼠其他組織中Snhg5的表達(dá)水平的檢測(cè) Fig.3 Detection of Snhg5 expression level in the multiple tissues of transgenic miceNote: A. Detection of Snhg5 expression level in heart tissue from control and transgenic mice; B. Detection of Snhg5 expression level in other tissues from control and transgenic mice

2.4 Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠在異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)之后更容易發(fā)生心臟重塑

對(duì)基礎(chǔ)水平和ISO處理情況下轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠心臟組織的大體形態(tài)和組織學(xué)變化情況檢測(cè)結(jié)果顯示，盡管2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠的心臟大體形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)在基礎(chǔ)水平無明顯差異(圖4)，但在ISO處理情況下，轉(zhuǎn)基因小鼠較對(duì)照小鼠更容易發(fā)生心臟增大(圖4A)，心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度或體重比值明顯增加(圖4B和4C)，心室壁增厚(圖4 D和4E)，以及心肌細(xì)胞面積增加(圖4F和4 G)，這些結(jié)果表明，與對(duì)照小鼠相比，Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠在ISO處理后更容易發(fā)生心肌肥厚，提示Snhg5會(huì)促進(jìn)心臟重塑的發(fā)生。

圖4 Snhg5過表達(dá)加重ISO引發(fā)的心肌肥厚注：A．心臟大體形態(tài)分析；B，C：鼠心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度比值，小鼠心臟質(zhì)量骨長(zhǎng)度比值統(tǒng)計(jì)結(jié)果，n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0005；D，E：心臟組織切片的H&E和Masson染色結(jié)果；F. 心臟組織切片的Laminin免疫熒光染色結(jié)果；G. 小鼠心臟切片細(xì)胞表面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，n=3，*P<0.05Fig.4 Overexpression of Snhg5 aggravates ISO-induced cardiac hypertrophyNote: A. Cardiac gross morphology analysis of different groups of mice; B, C:Ratio of heart weight to tibia length or body weight,n= 5, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0005; D, E: H&E and Masson staining results of heart tissue sections; F.Laminin immunofluorescence staining of heart tissue sections; G:Statistical results of cell surface area of heart sections, n=3, *P<0.05

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或胚胎干細(xì)胞內(nèi)，以隨機(jī)插入或同源重組的方式整合到受體染色體中，并隨細(xì)胞的分裂而遺傳給后代的技術(shù)[10]，通過該技術(shù)為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供了一系列理想的疾病模型。隨著LncRNA在心臟中功能研究的深入，建立心臟組織特異性LncRNA轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型對(duì)于研究LncRNA在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能和相關(guān)機(jī)制非常必要，而目前僅有少量心臟組織特異性LncRNA轉(zhuǎn)基因小鼠模型被報(bào)道[11-12]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Snhg5在主動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)(TAC)引起的病理性心肌肥厚和心衰小鼠模型心臟組織中表達(dá)水平明顯升高。為了研究Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，本研究中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了心肌細(xì)胞特異性Snhg5轉(zhuǎn)基因小鼠，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同組織內(nèi)Snhg5的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Snhg5只在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中表達(dá)水平明顯升高，表明該轉(zhuǎn)基因小鼠建立成功，為研究Snhg5在心臟組織中的功能提供了理想的動(dòng)物模型。

目前關(guān)于Snhg5功能的研究大多局限在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中。Snhg5在多種癌癥中異常表達(dá)，影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期和自噬等[13]。Snhg5可以作為miRNA的 sponges調(diào)控癌癥的表型和惡性程度[14]。Snhg5還可以通過調(diào)控包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路在內(nèi)的一些重要的信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[15]，從而影響癌癥的發(fā)生及進(jìn)展。此外，Snhg5還可作為腫瘤的血清學(xué)診斷分子標(biāo)志物[16]。而迄今為止，關(guān)于Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中是否發(fā)揮功能尚未見報(bào)道。通過對(duì)建立的心肌細(xì)胞特異性Snhg5小鼠進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)盡管轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟組織形態(tài)在基礎(chǔ)水平與對(duì)照小鼠無明顯差別，但在特定病理刺激下更容易發(fā)生心臟重塑，表明Snhg5過表達(dá)會(huì)促進(jìn)心臟重塑。

綜上所述，心肌細(xì)胞特異性Snhg5過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立不僅有助于揭示Snhg5在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能，還可能成為研究人類心臟疾病發(fā)生機(jī)制、開展新藥研發(fā)及療效評(píng)價(jià)的理想動(dòng)物模型。