T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)的研制

李妍， 楊鎮(zhèn)州， 梁文

上海市計量測試技術研究院化學與電離輻射所，國家市場監(jiān)管重點實驗室（生物分析計量溯源），上海 201203

流式細胞技術（flow cytometry，F(xiàn)CM）是通過流式細胞儀實現(xiàn)的一種單細胞定量分析以及分選技術，屬于綜合性技術，臨床中稱作流式細胞分析，主要通過對流式細胞儀的應用，對懸浮細胞進行測量，并根據(jù)對計算機、流體力學、電子等生物技術學科的應用對細胞進行分析［1］。流式細胞技術逐漸被應用于諸多領域的檢驗，如細胞生物檢驗、腫瘤檢驗、血液檢驗等［2-4］。

目前，臨床檢驗過程中已經(jīng)將流式細胞技術作為機體免疫狀況評價的主要檢測技術，檢驗指標以T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷淋巴細胞的水平為主，此外，CD4+T細胞的減少常見于惡性腫瘤，且其是遺傳性免疫缺陷癥、艾滋病、霍奇金淋巴瘤等的重要特征［5-7］。WS/T 360-2011《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》［8］中要求實驗室開展室內(nèi)質(zhì)量控制工作，對于特殊實驗，如艾滋病CD4+T細胞計數(shù)，至少每周進行一次質(zhì)控檢測。目前市場上銷售的流式細胞儀產(chǎn)品種類繁多，已有JJF 1665-2017《流式細胞儀校準規(guī)范》［9］、YY/T 0588-2017《流式細胞儀》［10］兩項針對流式細胞儀進行性能評價的標準或規(guī)范，其中在檢測校準儀器的示值誤差和重復性時需要用到細胞標準物質(zhì)。目前國內(nèi)外用于流式細胞儀校準用的細胞有證標準物質(zhì)（certified reference materials，CRM）研制較少，可檢索到的僅有中國計量科學研究院研制的淋巴細胞CD4+細胞占總淋巴細胞計數(shù)比例標準物質(zhì)（GBW（E）090938），標準值為49.4%，不確定度4.8%。由于常用的細胞質(zhì)控品保存條件苛刻，有效期短，國內(nèi)的淋巴細胞有證標準物質(zhì)稀少。本文采用磁珠純化方法獲得T淋巴細胞，并將純化后的細胞分裝于西林瓶中冷凍干燥，制備一批T淋巴細胞CD4+比例標準物質(zhì)候選物。同時，聯(lián)合8家檢測實驗室對標準物質(zhì)候選物協(xié)同定值，檢測標準物質(zhì)的均勻性和儲存穩(wěn)定性，以期為CD4+T細胞的檢測提供精準的標準物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

流式細胞儀（美國BD公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）；離心機（中國盧湘儀公司）；超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1×PBS pH7.2（Gibco公司）；CD4-FITC抗體（Beckman Coulter公司）；CD4-PE/CD3-FITC/CD45-Per-CP混合抗體（BD公司）；人總T細胞分選試劑盒（Miltenyibiotec公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準物質(zhì)的制備和純度驗證 首先將人工制備的T淋巴細胞進行磁珠分選純化，將2.5×108個外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）重懸后按照人總T細胞分選試劑盒說明書進行分選純化。將收集到的純化后細胞用流式細胞術進行純度驗證。樣品中加入CD-PE/CD3-FITC/CD45-PerCP混合抗體染色后上機流式細胞儀進行檢測，門內(nèi)至少收集10 000個細胞。然后分裝制備一批T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物，共計200瓶，每瓶200μL。

1.2.2 標準物質(zhì)的均勻性檢驗 按照文件JJF1006-1994《一級標準物質(zhì)技術規(guī)范》［11］中標準物質(zhì)的均勻性考察的單元樣品抽取原則，T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物制備單元為200瓶，本項目隨機抽取15瓶進行檢測，每瓶樣品重復檢測3次，共15組45個數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法（F檢驗）檢驗均勻性。

1.2.3 標準物質(zhì)的穩(wěn)定性考察方法 為了評估標準物質(zhì)樣品在運輸過程中是否需要特殊條件，要對不同溫度下放置不同時間后的樣品進行短期穩(wěn)定性統(tǒng)計評估。實驗模擬樣品在運輸中可能遇到的條件，將制備的T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物放置在20℃（模擬室溫）、4℃（模擬冰袋）和-20℃（模擬干冰）條件下，在0、1、3、5、7、10、15天隨機選取3個單元進行檢驗，每個單元重復測3次（N=3，n=3），以平均值作為檢測結(jié)果。為了評估樣品在客戶端的儲存條件和使用有效期，將制備的T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物放置在-20℃冰箱儲存，分別在樣品第0、1、2、3、4、5、6、9、12個月對制備的標準物質(zhì)進行長期穩(wěn)定性考察，每個時間點隨機選取3個單元進行檢驗，每個單元重復測3次（N=3，n=3），以平均值作為檢測結(jié)果。根據(jù)T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)在不同溫度下其CD4+細胞比例隨時間的變化描繪出CD4+百分比Y與保存時間X的關系，擬合成的直線通過公式（1）計算直線斜率b1，通過公式（2）計算直線的斜率b1不確定度s（b1）。

1.2.4 標準物質(zhì)定值 采用流式細胞微球計數(shù)法進行定值。取100μL處理好的細胞樣品和100μL標物微球均勻混合，然后上機檢測，圈門得到獲取微球數(shù)、獲取CD4+細胞數(shù)及獲取總淋巴細胞數(shù)，根據(jù)熒光微球標準物質(zhì)的標準個數(shù)和樣品體積計算出微球數(shù)，并根據(jù)公式（3）計算出CD4+細胞的絕對個數(shù)，并用公式（4）計算出淋巴細胞個數(shù)。

式中，C1表示CD4+細胞個數(shù)；c1表示獲取CD4+細胞數(shù)；C2表示淋巴細胞個數(shù)；c2表示獲取淋巴細胞數(shù)；m表示獲取微球數(shù)；M表示標準微球數(shù)；V表示樣品體積。因此，淋巴細胞樣品中CD4+細胞個數(shù)的百分比見公式（5）。

通過將已知個數(shù)的微球標準物質(zhì)作為計數(shù)淋巴細胞的參比，流式細胞儀檢測的CD4+細胞的個數(shù)和其比例的檢測結(jié)果可以得到很好的量值溯源。本文按照JJF 1343-2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》［12］的文件要求，聯(lián)合8家實驗室進行T淋巴細胞CD4+比例標準物質(zhì)候選物的定值。通過將已知個數(shù)的微球標準物質(zhì)作為計數(shù)淋巴細胞的參比，采用流式細胞儀檢測CD4+細胞比例的結(jié)果可以得到很好的量值溯源。

1.2.5 不確定度評定 T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)的不確定度組成包括：不均勻性引起的不確定度和標準物質(zhì)的特性量值在長期穩(wěn)定性內(nèi)的變化性引起的不確定度和特性量值的定值過程引起的不確定度。①均勻性引入的不確定度。均勻性分析結(jié)果表明，T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)的瓶間差異極小，均勻性引入的不確定度見公式（6）。

②穩(wěn)定性引入的不確定度。在12個月的穩(wěn)定性檢測中，有效期t=12月長期穩(wěn)定性引起的不確定度見公式（7）。

③定值過程引入的不確定度。標準物質(zhì)定值過程引入的不確定度包括：數(shù)據(jù)統(tǒng)計引入的不確定度和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度。T淋巴細胞CD4+比例標準物質(zhì)由數(shù)據(jù)統(tǒng)計引入的不確定度為由8組測量結(jié)果計算的A類不確定度。合成A類標準不確定度見公式（8）。

通過對測量過程的分析，以非統(tǒng)計分析的方法評定合成B類標準不確定度，定值方法的數(shù)學模型見公式（5）。

式中，c1表示獲取CD4+細胞數(shù)；m表示獲取微球數(shù)；M表示標準微球數(shù)；V表示樣品體積；c2表示獲取淋巴細胞數(shù)。則由此得到的相對標準不確定度傳播率公式（9）。

其中CD4+細胞占淋巴細胞比例X的標準不確定度用uc(X)表示，CD4+細胞獲取個數(shù)的不確定度為uc(C1)；淋巴細胞獲取個數(shù)的不確定度為uc(C2)；微球獲取個數(shù)的不確定度為uc(m)；微球標準物質(zhì)引入的不確定度為uc(M)；樣品體積引入的不確定度為uc(V)。

④相對擴展不確定度。標準物質(zhì)的合成相對標準不確定度見公式（10）。

按慣例，若取包含因子k=2（95%的置信區(qū)間），則標準物質(zhì)的相對擴展不確定度見公式（11）。

2 結(jié)果與分析

2.1 純度驗證

純化后的細胞樣品濃度減少為10%，去除了90%的非目標雜質(zhì)細胞，細胞樣品中FITC-CD4+比例增加2.6倍。純化后的細胞樣品經(jīng)過多色流式細胞檢測（圖1）后確認其T淋巴細胞純度為99.7%。

圖1 細胞分選純化前后的流式細胞檢測散點圖Fig.1 Flow cytometry scatter plot before and after cell sorting and purification

2.2 均勻性考察

本文采用方差分析法對T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物進行均勻性評價。在研制的200瓶標準物質(zhì)候選物中隨機抽取15個樣本，不改變測量條件，將測得的數(shù)據(jù)用方差分析法檢驗，檢測的數(shù)據(jù)組間方差和組內(nèi)方差沒有顯著性差異。統(tǒng)計結(jié)果符合JJF1006-1994《一級標準物質(zhì)技術規(guī)范》［11］中對標準物質(zhì)的均勻檢驗合格要求，證明研制的T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)是均勻的。

2.3 穩(wěn)定性考察

依據(jù)公式（1）（2），采用線性模型作為該標準物質(zhì)的經(jīng)驗模型進行短期穩(wěn)定性評價，本文研制的淋巴細胞標準物質(zhì)在4℃和-20℃下保存10 d是穩(wěn)定的。綜合上述，我們規(guī)定運輸條件為：使用冰袋，全程保證冷鏈運輸，運輸時間不超過10 d。

依據(jù)公式（1）（2），采用線性模型作為該標準物質(zhì)的經(jīng)驗模型進行長期穩(wěn)定性評價，標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性結(jié)果統(tǒng)計（表1）表明，淋巴細胞標準物質(zhì)在12個月內(nèi)-20℃的保存條件下穩(wěn)定，然而在4℃保存3個月后的標準物質(zhì)CD4+百分比檢測結(jié)果SD變大，且流式細胞儀檢測散點圖顯示CD4+和陰性信號區(qū)分度變差（圖2），說明樣品表面的抗原不穩(wěn)定。因此，我們規(guī)定標準物質(zhì)的長期儲存條件為-20℃冷凍儲存。

圖2 標準物質(zhì)在-20℃和4℃溫度下保存3個月的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.2 Flow cytometry results of standard materials stored at-20℃and 4℃for 3 months

表1 標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Long-term stability test results of reference materials

2.4 聯(lián)合定值

標準物質(zhì)中CD4+占總淋巴細胞的比例，量值單位是百分比（%）。通過將已知個數(shù)的微球標準物質(zhì)作為計數(shù)淋巴細胞的參比，確保流式細胞儀檢測的CD4+細胞占總淋巴細胞的比例的檢測結(jié)果準確。本研究選擇了8家實驗室，參與定值的實驗室均通過了由定值負責實驗室組織的盲樣考核。每個單位分別隨機抽取4瓶標準物質(zhì)，每瓶樣品平行測定2次，進行定值分析。

依據(jù)JJF1343-2012《標準樣品定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》［12］，T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)候選物采用8家實驗室聯(lián)合定值的方法。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)（表2），對所有數(shù)據(jù)按如下程序處理：利用格拉布斯（Grubbs）法和狄克遜（Dixon）法判斷各組內(nèi)數(shù)據(jù)無可疑值，利用柯克倫（Cochran）法判斷這8組數(shù)據(jù)等精度；利用狄克遜（Dixon）法對每組數(shù)據(jù)的平均值進行檢驗，無統(tǒng)計學差異。然后求出所有數(shù)據(jù)的平均值即為標準物質(zhì)的特性量值，為74.0%。

表2 標準物質(zhì)的8家單位定值數(shù)據(jù)Table 2 Quantified test results of reference materials by 8 laboratories

2.5 不確定度評定

T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)的不確定度組成包括：不均勻性引起的不確定度和標準物質(zhì)的特性量值在長期穩(wěn)定性內(nèi)的變化性引起的不確定度和特性量值的定值過程引起的不確定度。各項不確定度的具體數(shù)據(jù)見表3。標準物質(zhì)的合成相對標準不確定度urel=0.045，則標準物質(zhì)的相對擴展不確定度uCRM=k·urel=2×0.045=0.09。標準物質(zhì)的標準值為CD4+細胞比例C=74.0%，則其擴展不確定度為U=uCRM·C=0.09×74.0%=6.7%。

表3 標準物質(zhì)的不確定度分量Table.3 Uncertainty component of reference materials

3 討論

目前，WS/T 360-2011《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》［8］中要求實驗室開展室內(nèi)質(zhì)量控制工作，采用的細胞質(zhì)控品是全血質(zhì)控品，由于質(zhì)控品的儲藏條件苛刻且處理方法復雜，特性量值無法有效溯源，不適用于儀器計量校準。本研究分析了T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)的研制方法，采用流式細胞微球計數(shù)法多家實驗室合作定值，量值可靠，準確性和均勻性良好。本文研制的T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)在規(guī)定時間內(nèi)保存在-20℃無明顯的上升或下降趨勢，然而在4℃保存3個月后的標準物質(zhì)CD4+百分比檢測結(jié)果SD變大，且流式細胞儀檢測散點圖顯示CD4+和陰性信號區(qū)分度變差，說明樣品表面的抗原不穩(wěn)定，不適宜在4℃長期保存。因此，本文研制的標準物質(zhì)可以穩(wěn)定保存12個月。標準物質(zhì)候選物由8家實驗室進行流式細胞微球計數(shù)法協(xié)同定值，并經(jīng)過不確定度評估，研制的T淋巴細胞亞群CD4+比例標準物質(zhì)中CD4+細胞比例的量值為74.0%±6.7%（k=2）。該項目的成果可以適用于流式細胞儀的計量校準，以及流式細胞術檢測過程的方法驗證和檢測結(jié)果的質(zhì)量控制，提高流式細胞檢測結(jié)果的可靠性和準確性。