CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類及研究現(xiàn)狀

高維崧， 竇金萍， 韋雙， 劉興健， 張志芳， 李軼女

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著人們對(duì)基因的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段，圍繞基因開(kāi)展的研究逐年增加，相關(guān)研究技術(shù)也隨之迅猛發(fā)展，其中基因編輯技術(shù)從早期的同源重組技術(shù)，已發(fā)展為核酸酶基因編輯技術(shù)、基于人工核酸酶的鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nucleases，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)的核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effectors nucleases，TALEN），近年來(lái)，規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）快速發(fā)展，成為新一代的基因編輯技術(shù)。CRISPR技術(shù)因具有操作簡(jiǎn)單、編輯效率高等優(yōu)勢(shì)，已廣泛運(yùn)用于基因育種、新藥研發(fā)、疾病治療等領(lǐng)域，被稱為第三代基因編輯技術(shù)?；贑RISPR技術(shù)的不同用途，更多種類的CRISPR/Cas（CRISPR-associated）系統(tǒng)逐漸被發(fā)現(xiàn)和完善。本文旨在對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源和發(fā)展進(jìn)行綜述，并重點(diǎn)介紹CRISPR技術(shù)分類的發(fā)展及各類型的特點(diǎn)，以期借助已知的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)新的Cas蛋白，并發(fā)掘CRISPR/Cas系統(tǒng)更多的應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的起源和發(fā)展

1987 年日本大阪大學(xué) Ishino等［1］首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)具有短重復(fù)序列（short sequence repeats，SSR）的特點(diǎn)；2000年Mojica等［2］發(fā)現(xiàn)這些SSR存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌中，并將其命名為規(guī)則的短間隔重復(fù)序列（short regularly spaced repeats，SRSRs）；2001年，She等［3］進(jìn)一步命名為大簇的20 nt串聯(lián)重復(fù)序列（large cluster of 20-nt tandem repeat sequences，LCTR）；2002年，Jansen等［4］先后將這段序列命名為間隔的正向重復(fù)序列（spacers interspaced direct repeats，SPIDR）和CRISPR［5］，同時(shí)將與其功能可能相關(guān)的4個(gè)基因（Cas1、Cas2、Cas3、Cas4）命名為CRISPR-associated（Cas）基因，且這種命名方式沿用至今，在后續(xù)的研究中，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的Cas基因也按照數(shù)字規(guī)律命名。

2012年Jinek等［6］研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA引導(dǎo)Cas9蛋白的系統(tǒng)可以導(dǎo)致目標(biāo)基因的DNA雙鏈斷裂，即理論上通過(guò)改變RNA的序列可以實(shí)現(xiàn)對(duì)任何基因進(jìn)行編輯，并預(yù)言CRISPR/Cas系統(tǒng)作為基因編輯技術(shù)具有巨大潛力。2013年，Cong等［7］對(duì)化膿性鏈球菌的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并加入了核定位信號(hào)來(lái)促進(jìn)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中的表達(dá)，最終成功對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因進(jìn)行了編輯，正式開(kāi)啟了CRISPR/Cas系統(tǒng)在生命科學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用；同時(shí)該實(shí)驗(yàn)室還開(kāi)發(fā)出了配套的sgRNA設(shè)計(jì)程序和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒載體，以提高該方法的編輯效率。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展與改進(jìn)，使用CRISPR載體對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行基因編輯已經(jīng)變得十分簡(jiǎn)便，尤其是其在基因治療研究領(lǐng)域的應(yīng)用，為從根源上治愈一些目前傳統(tǒng)醫(yī)療手段難以治療的遺傳性疾病帶來(lái)新的希望［8］。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)分類的變更歷史

2005年，Haft等［10］基于40多種細(xì)菌和真菌的分析結(jié)果，結(jié)合Cas1蛋白進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)鋵W(xué)分析以及Cas基因的操縱子序列信息等方面的差異，首次對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行了分類，并將其分別歸于8個(gè)基因組中，4個(gè)核心蛋白的名字沿用了2002年Jansen等［5］的命名方式，而8個(gè)基因組中編碼蛋白的基因命名由細(xì)菌來(lái)源和數(shù)字組成，如cse1（CRISPR system of E.coli gene number 1）［9］，這種分類方法雖然簡(jiǎn)單，但對(duì)于關(guān)系較遠(yuǎn)又有一定聯(lián)系的蛋白分類命名并不科學(xué)。

2011年，美國(guó)國(guó)立生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提出了一種以Cas1、Cas2基因?yàn)橄到y(tǒng)核心的全新分類方式。Makarova等［11］基于系統(tǒng)發(fā)育、基因組和結(jié)構(gòu)分析的證據(jù)將現(xiàn)有的CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，大多數(shù)的CRISPR/Cas系統(tǒng)可歸于3個(gè)類型之中，其余暫時(shí)無(wú)法分類的命名為U型，并將之前發(fā)現(xiàn)的部分基因進(jìn)行了重新分類命名，如將I-C中的cmx5重命名為Cas5，cmx6重命名為Cas6，在亞型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步引用字母來(lái)避免一些同源基因無(wú)法被分類，如cse3和csy4被重命名為 Cas6e和Cas6f。

2015年，Makarova等［12］對(duì)所有已知的 93個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)的蛋白家族進(jìn)行分析并建立了一個(gè)包括394個(gè)位置特異性計(jì)分矩陣（positionspecific scoring matrices，PSSM）的書(shū)庫(kù)，其中229個(gè)PSSMs是新增的，其利用這些矩陣搜索了2 751個(gè)完整注釋過(guò)細(xì)菌和真菌的基因組，預(yù)測(cè)出了1 694個(gè)完整Cas基因的基因座。最終，1 574個(gè)（93%）完整的基因座被分入先前已經(jīng)分出的類型中或者新分類出的Ⅳ型、Ⅴ型系統(tǒng)中。經(jīng)過(guò)分析總結(jié)，Makarova等［12］認(rèn)為應(yīng)從更廣泛、更基礎(chǔ)的角度對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行分類，即應(yīng)將擁有多亞基crRNA效應(yīng)復(fù)合物的歸入一類，而少數(shù)蛋白亞基行使功能的被歸入另一類，向下分類可以分出5個(gè)型，16個(gè)亞型，進(jìn)而形成了現(xiàn)在應(yīng)用的分類方法。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類現(xiàn)狀

截至2019年3月1日，NCBI上共有13 116個(gè)完整的古細(xì)菌和細(xì)菌的基因組，利用Blast技術(shù)可以鑒定到 7 915個(gè) Cas位點(diǎn)［13］。NCBI通過(guò)實(shí)驗(yàn)、計(jì)算等方法對(duì)這些基因位點(diǎn)進(jìn)行分析與分類，不符合先前發(fā)現(xiàn)特點(diǎn)的Cas基因被列入新的型或亞型中，此外還利用一些基因組的預(yù)測(cè)工具，對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行了分析與預(yù)測(cè)。截至2019年 Makarova等［13］關(guān)于CRISPR/Cas系統(tǒng)分類的研究中，亞型的分類數(shù)量達(dá)到了33個(gè)，較2015年增加了1倍，并且分出兩個(gè)新的型，包括蛋白體型比Ⅱ型更小的Ⅴ型系統(tǒng)［14-15］，和以RNA為切割目標(biāo)的Ⅵ型［16］。目前來(lái)看，這種分類方法已經(jīng)逐漸趨向于穩(wěn)定，對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類也趨近于補(bǔ)充和完善的階段?，F(xiàn)在已知的CRISPR/Cas系統(tǒng)分為2個(gè)大類6個(gè)型，每個(gè)型又分為多個(gè)亞型，每個(gè)型包含的Cas蛋白也存在差異，詳見(jiàn)表1。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)包含的亞型與蛋白[13]Table 1 Subtypes and proteins contain in CRISPR/Cas systems[13]

3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)中的第一大類

CRISPR/Cas系統(tǒng)中的第一大類系統(tǒng)中包含的蛋白是由多個(gè)Cas蛋白組成的效應(yīng)模塊，其中一些組成crRNA結(jié)合復(fù)合物，共同發(fā)揮作用。從起源來(lái)看，組成第一大類的工作元件是從不同的系統(tǒng)中移動(dòng)組合而來(lái)的。整體來(lái)看第一大類的核心蛋白是解旋酶Cas3、Cas8和聚合酶Cas10組成的復(fù)合體［17］。第一大類進(jìn)一步可分為Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型3個(gè)型。

3.1.1 Ⅰ型 目前在CRISPR/Cas系統(tǒng)中Ⅰ型占比最高，且含有很多有缺陷的亞型，如Ⅰ-F和Ⅰ-B亞型。Cas1、Cas2是目前CRISPR/Cas系統(tǒng)中保守性最高的蛋白，幾乎所有的CRISPR/Cas系統(tǒng)中第一階段都有Cas1和Cas2的參與。Cas1蛋白有整合酶的作用，其可以切割細(xì)菌基因組上重復(fù)區(qū)的特異位點(diǎn)，再將外源基因插入其中。在大腸桿菌中觀察到Cas2會(huì)與Cas1結(jié)合形成復(fù)合物，但Cas2蛋白的活性區(qū)域被突變破壞后系統(tǒng)仍能獲取外來(lái)核酸，這表明Cas2蛋白可能存在其他特殊的功能，與Cas1蛋白整合酶的功能不同［18］。Cas1基因通常與其他Cas基因共同存在，并與所有Ⅰ型、Ⅱ型系統(tǒng)、大部分Ⅲ-A亞型系統(tǒng)和部分Ⅲ-B亞型系統(tǒng)相關(guān)［19］，這對(duì)于CRISPR/Cas系統(tǒng)亞型的分類具有重要意義。

Cas3蛋白負(fù)責(zé)目標(biāo)核酸的切割，其既是Ⅰ型系統(tǒng)的標(biāo)志，又是很多亞型中均含有的蛋白，由于Cas3存在普遍性，推測(cè)Cas3可能有重要的功能。Cas3蛋白上有ATP的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其可能與ATP結(jié)合并有ATP酶的活性，之后的研究表明這種活性在單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）存在時(shí)會(huì)顯著增強(qiáng)，而雙鏈DNA（dsDNA，doublestranded DNA）和RNA的存在并不會(huì)影響Cas3的ATP酶活性［20］。因此認(rèn)為Cas3蛋白具有ssDNA依賴的ATP酶活性，并可以降解ssDNA。

Cas4蛋白廣泛存在于Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅴ型系統(tǒng)中，因而在大部分CRISPR/Cas系統(tǒng)中都可以找到Cas4蛋白，對(duì)其功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Cas4蛋白有助于適應(yīng)階段的定位過(guò)程［21］。實(shí)驗(yàn)證明，敲除Cas4蛋白基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)一些病毒適應(yīng)能力喪失［22］。Plagens等［23］的研究顯示，Cas4 蛋白與Cas1和Cas2蛋白間存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，進(jìn)一步研究證明Cas4蛋白參與適應(yīng)階段。Cas4蛋白單獨(dú)存在時(shí)未表現(xiàn)出活性，而與Cas1或Cas2結(jié)合后，復(fù)合物可以依次對(duì)間隔序列進(jìn)行加工，完成適應(yīng)階段的功能。

在絕大多數(shù)Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)中，對(duì)precrRNA進(jìn)行加工的工作主要是由來(lái)自重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白（repeat-associated mysterious proteins，RAMPs）家族的Cas6蛋白完成的。在某些亞型，如Ⅰ-C系統(tǒng)中，Cas6蛋白加工pre-crRNA的工作由同樣來(lái)自RAMPs家族的Cas5蛋白完成［24］，而在Ⅰ-E系統(tǒng)中，Cas5和Cas6組成蛋白復(fù)合物來(lái)共同完成這部分工作［25］。

3.1.2 Ⅲ型 Ⅲ型系統(tǒng)是特殊的CRISPR類型，因其不僅具有對(duì)入侵DNA的抵抗能力，還表現(xiàn)出對(duì)入侵RNA的抵抗能力，Cas10蛋白是Ⅲ型中的標(biāo)志蛋白，有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。在Ⅲ-E型系統(tǒng)中，Cas7與Cas11組成多亞基的蛋白集合體，這個(gè)集合體可以在無(wú)其他蛋白的輔助下加工生成成熟的crRNA，具有很高的切割特異性，但切割效率低于理想值。從形態(tài)來(lái)看Ⅲ-E型系統(tǒng)雖然類似于第二大類的CRISPR/Cas系統(tǒng)，但是經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域和序列的分析，最終還是被列入了Ⅲ型中。與其他Ⅲ型系統(tǒng)不同，Ⅲ-F型系統(tǒng)在2015年就被鑒定出來(lái)，但因?yàn)榉N類太少不具備成為單獨(dú)亞型的條件，2019年分類時(shí)，Ⅲ-F型系統(tǒng)已在12個(gè)基因組中被發(fā)現(xiàn)，因此才將其分為單獨(dú)的亞型。Ⅲ-F型系統(tǒng)內(nèi)部有類似Cas7和Cas10的蛋白質(zhì)，因此被預(yù)測(cè)為可以切割DNA，但類似于Cas10蛋白的亞基上環(huán)化酶和聚合酶的結(jié)構(gòu)域無(wú)活性［26］。雖然Ⅲ型是發(fā)現(xiàn)較早的對(duì)RNA有切割功能的CRISPR/Cas系統(tǒng)，但目前對(duì)RNA改造的熱點(diǎn)為體型更小的Ⅵ型系統(tǒng)，原因可能是多亞基的第一大類系統(tǒng)實(shí)際應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域存在諸多問(wèn)題。

3.1.3 Ⅳ型 最初的Ⅳ型系統(tǒng)是在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的，且最開(kāi)始被分類為U型。Ⅳ型系統(tǒng)很多都缺少類似于切割核酸的核酸酶蛋白，但其間隔區(qū)序列中可以檢測(cè)到來(lái)自不同質(zhì)粒的核酸，因此猜測(cè)Ⅳ型的CRISPR功能可能與抵抗外來(lái)質(zhì)粒有關(guān)。Ⅳ型系統(tǒng)的起源目前仍不確定，但基因分析顯示Ⅳ型系統(tǒng)中有類似于Cas5和Cas7的蛋白質(zhì)［27］，這些證據(jù)顯示效應(yīng)復(fù)合物Ⅳ型系統(tǒng)可能是高度分化的Ⅰ型或Ⅲ型系統(tǒng)的衍生物［28］。

3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的第二大類

第二大類系統(tǒng)中的功能蛋白包含的是單個(gè)、多結(jié)構(gòu)域的crRNA的結(jié)合蛋白，這個(gè)結(jié)合蛋白包含了實(shí)行切割核酸需要的全部組件。第二大類系統(tǒng)一直是研究應(yīng)用的熱點(diǎn)，其僅需要一個(gè)基團(tuán)就能完成第一大類系統(tǒng)許多基團(tuán)共同合作才能完成的工作。目前第二大類的CRISPR/Cas系統(tǒng)比第一大類中的系統(tǒng)更簡(jiǎn)便，是生物技術(shù)應(yīng)用的首選。第二大類雖然僅占整個(gè)CRISPR/Cas系統(tǒng)的20%，但研究較多，并進(jìn)一步發(fā)展為基因編輯的工具，第二大類分類中包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型3個(gè)型。

3.2.1 Ⅱ型 Ⅱ型系統(tǒng)中的代表為CRISPR/Cas9蛋白系統(tǒng)，目前使用的Cas9蛋白主要是源于產(chǎn)膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。Ⅱ型系統(tǒng)發(fā)揮功能的過(guò)程中Cas1、Cas2、Cas4蛋白負(fù)責(zé)重復(fù)間隔區(qū)的建立，且在表達(dá)階段有RNaseⅢ來(lái)幫助crRNA的形成，而剩余的工作由Cas9蛋白完成。在Cas9發(fā)揮功能的過(guò)程中，有兩類RNA發(fā)揮了作用，crRNA可以與DNA上的部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)Cas9蛋白與DNA的結(jié)合，且tracrRNA（trans-activating crRNA）可以促進(jìn) crRNA 的成熟［12］。當(dāng)crRNA引導(dǎo)RNA與Cas9蛋白組成的切割復(fù)合體移動(dòng)到特定位點(diǎn)后，Cas9蛋白的兩個(gè)DNA切割結(jié)構(gòu)域（HNH和RuvC）開(kāi)始發(fā)揮作用，HNH結(jié)構(gòu)域切割與crRNA互補(bǔ)的鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域切割另一條鏈。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種新型基因編輯技術(shù)，因具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)勢(shì)，已成為CRISPR/Cas系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，且逐漸運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域，如其可將家禽的NHE1基因精確敲除，并制備出對(duì)禽白血病病毒J亞群產(chǎn)生抗性的個(gè)體［29］；對(duì)Top1基因進(jìn)行操作甚至可以100%控制小鼠后代的性別［30］；通過(guò)基因編輯改變傳統(tǒng)的育種方法［31］，如通過(guò)敲除基因PYL1、PYL4、PYL6可以增加水稻的粒數(shù)和粒長(zhǎng)［32］，敲除基因 GW2、GW5、TGW6可以提高水稻粒的質(zhì)量［33］；檢測(cè)食品中微生物的源頭來(lái)預(yù)防疾病的爆發(fā)［34］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)除了基礎(chǔ)的通過(guò)雙鏈斷裂來(lái)進(jìn)行基因編輯外，經(jīng)過(guò)改造和修飾后，其還開(kāi)發(fā)了更多的用途，如使Cas蛋白的核酸切割部位失活后，Cas蛋白到目標(biāo)位點(diǎn)附近后就不會(huì)進(jìn)行核酸的切割，最終形成無(wú)活性的Cas9蛋白，即dCas9蛋白，在Cas蛋白上面連接一些轉(zhuǎn)錄抑制因子或者轉(zhuǎn)錄激活因子，就可以對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的基因進(jìn)行抑制或者激活，通過(guò)將細(xì)胞核定位信號(hào)和表位標(biāo)簽引入dCas9，標(biāo)記靶標(biāo)基因和其相互作用的蛋白質(zhì)來(lái)達(dá)成染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）的 目 的［35-36］，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可用于研究表觀遺傳學(xué)編輯、染色質(zhì)狀態(tài)及細(xì)胞分化或疾病進(jìn)程等表型之間的關(guān)系［37］。

3.2.2 V型 2015年Zetsche等［38］經(jīng)過(guò)分析新定義了一種類型——Ⅴ型，之前發(fā)現(xiàn)的蛋白名稱在分出Ⅴ型系統(tǒng)后有了對(duì)應(yīng)的名稱，即Cpf1（Cas12a）、C2c1（Cas12b）、C2c2（Cas13a）、C2c3（Cas12c）、CasY（Cas12d）和 CasX（Cas12e）［39］。Ⅴ型系統(tǒng)與Cas9系統(tǒng)相似又存在差異，Cas9系統(tǒng)中形成crRNAs需要tracrRNA的幫助，而Cpf1系統(tǒng)則不需要；Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能時(shí)需要的PAM序列富含G堿基，而Cpf1系統(tǒng)的PAM序列富含T堿基；Cas9系統(tǒng)切割核酸的蛋白結(jié)構(gòu)域有HNH和RuvC這兩個(gè)，而Cpf1系統(tǒng)只有一個(gè)類似RuvC的結(jié)構(gòu)域。這就使得Cpf1的功能蛋白比Cas9小很多［40］，同時(shí)Cpf1系統(tǒng)在使用時(shí)僅需要1條42 nt左右的RNA，而不需如Cas9系統(tǒng)一樣插入1條100 nt左右的RNA序列。Cas9蛋白在切割雙鏈DNA后，留下的DNA末端為平末端，而Cas12a蛋白切割時(shí)則留下粘性末端，這種結(jié)構(gòu)有利于基因修復(fù)時(shí)的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），使得基因更精準(zhǔn)插入，至于單個(gè)核酸切割結(jié)構(gòu)域切割開(kāi)DNA雙鏈，其作用機(jī)理仍在研究中。

雖然Ⅴ型系統(tǒng)的技術(shù)研究尚不成熟，但因其具有檢測(cè)成本低、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，在很多領(lǐng)域率先得到了應(yīng)用，如基于Cas12a蛋白的核酸檢測(cè)技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)對(duì)蘋(píng)果樹(shù)中的主流病毒病進(jìn)行檢測(cè)［41］；利用Cas12a結(jié)合特異性的crRNA和熒光探針，可以使CRISPR技術(shù)用于肉類摻假的檢測(cè)［42］；針對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情，CRISPR/Cas系統(tǒng)也可發(fā)揮作用，一種基于Cas12a蛋白的技術(shù)可以篩選出流感病毒A、流感病毒B與新型冠狀病毒，為流行病學(xué)檢測(cè)篩查提供了一條新的途徑［43-44］；隨著細(xì)菌抗藥性逐漸增強(qiáng)，CRISPR技術(shù)也可作為治療細(xì)菌感染的一種新方法［45］。

3.2.3 Ⅵ型 最開(kāi)始對(duì)Ⅵ型系統(tǒng)的描述是發(fā)現(xiàn)了一種異于Ⅲ型系統(tǒng)的具有RNA切割能力的CRISPR/Cas系統(tǒng)，相比于多亞基組成功能單位的Ⅲ型系統(tǒng)，Ⅵ型系統(tǒng)的蛋白元件大小明顯更具優(yōu)勢(shì)。通過(guò)基因組識(shí)別陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了C2c2（Cas13a）、Cas13b［46］、Cas13c等RNA引導(dǎo)的RNA內(nèi)切酶［16］。目前運(yùn)用Cas13仍具有挑戰(zhàn)性，原因?yàn)樵缙谘芯康腃as13編輯器大小與常用的腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）載體承載能力不合適，而且目前Ⅵ型系統(tǒng)的脫靶率遠(yuǎn)超過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，部分Cas13家族的蛋白體型更小，因此，可將這些小體積Cas蛋白包裝進(jìn)AAV載體中，來(lái)促進(jìn)Ⅵ型系統(tǒng)的應(yīng)用［47］。目前Ⅵ型在很多領(lǐng)域都展開(kāi)了應(yīng)用［48］，且近兩年新冠疫情的爆發(fā)在一定程度上也加速了Ⅵ型系統(tǒng)的發(fā)展，已有很多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始利用Cas13蛋白的特性來(lái)快速檢測(cè)新型冠狀病毒［49］，以及研制對(duì)抗新型冠狀病毒甚至其他RNA病毒的小分子藥物［50］。

4 展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)規(guī)律的分類，標(biāo)志著CRISPR/Cas系統(tǒng)科學(xué)研究的規(guī)范化。從CRISPR技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域，到現(xiàn)今在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用僅經(jīng)過(guò)了短短幾年的時(shí)間，但關(guān)于基因編輯技術(shù)的研究以穩(wěn)定的速度增長(zhǎng)，證明CRISPR技術(shù)是一種功能強(qiáng)大的基因編輯手段。但CRISPR技術(shù)仍有許多需要改進(jìn)的地方，如脫靶率高很大程度上阻礙了CRISPR技術(shù)在基因治療方面的應(yīng)用，未來(lái)對(duì)于技術(shù)的改進(jìn)可以側(cè)重于探索降低脫靶率的方法、尋找更適合的運(yùn)輸載體、減少工作元件的規(guī)模等方面，應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展也會(huì)促進(jìn)技術(shù)的更新。隨著生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，借助目前已知的蛋白，未來(lái)還可能發(fā)現(xiàn)更多新的CRISPR/Cas系統(tǒng)，或出現(xiàn)效率更高、安全性更好的新型Cas蛋白；同時(shí)通過(guò)更深入的研究，或許能夠發(fā)現(xiàn)不同微生物抵抗外來(lái)大分子物質(zhì)機(jī)制相似的部分，而微生物的抵抗機(jī)制與人類免疫系統(tǒng)是否存在相似之處尚有待進(jìn)一步挖掘。