富氫鹽水對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病的抑制作用

陳軍， 秦樹存， 何磊*

1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；

2.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）泰山氫生物醫(yī)學(xué)研究院，山東 泰安 271000

銀屑病是一種慢性炎癥性復(fù)發(fā)性疾病，銀屑病患者存在脂類、脫氧核糖核酸以及蛋白質(zhì)的嚴(yán)重氧化損傷。嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量，增加了患者及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。銀屑病的發(fā)病機制可能與炎性因子增多有關(guān)，伴隨血漿氧化相關(guān)因子的改變。參與銀屑病免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要涉及T淋巴細(xì)胞、類樹突樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。其中類樹突樣細(xì)胞或Th17細(xì)胞識別表皮抗原產(chǎn)生促炎因子、激活巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-23（interleukin-23，IL-23），從而顯著增強銀屑病的炎癥狀態(tài)。細(xì)胞因子、趨化因子在各種免疫細(xì)胞之間起到聯(lián)接樞紐作用，許多細(xì)胞因子在銀屑病的皮損或外周血中顯著升高，是銀屑病發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-17等［1］。氧化應(yīng)激是活性氧生成遠(yuǎn)超過機體抗氧化功能時的一種病理表現(xiàn)。

氫氣具有抗氧化、抗炎癥和抗凋亡的特性。并且無論在人群試驗還是在動物實驗中，都未產(chǎn)生明顯不良反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究和應(yīng)用中。許多研究顯示通過吸入氫氣、注射或飲用飽和氫氣溶液可以改善多種疾病，如在自身免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、代謝性疾病和腫瘤等眾多的疾病中均表現(xiàn)出良好的改善作用［2］。氫氣對于疾病的治療和改善的作用機理十分復(fù)雜，對其研究目前仍處于初級階段，其中抗炎、抗氧化只能部分解釋氫分子的保護(hù)作用。因此深入探究氫分子的作用機制仍然是目前氫分子生物學(xué)研究的重要課題。近年來氫也被廣泛應(yīng)用于多種皮膚病的研究中，且富氫水在皮膚疾病治療領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。最新的研究表明富氫水對于銀屑病，具有一定的治療和改善作用［3］，但是其作用機制尚不清楚。因此本研究擬采用咪喹莫特誘導(dǎo)的BALB/C小鼠銀屑病模型，通過蘇木素染色、實時定量PCR、目標(biāo)病灶銀屑病嚴(yán)重程度評分（target lesionpsoriasis severity score，TLPSS）、皮損組織學(xué)病理學(xué)評分（Baker score）、酶聯(lián)免疫檢測法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）、硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substance assay，TBARS）等方法，探究富氫鹽水對銀屑病持續(xù)性的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，旨在闡述富氫鹽水對銀屑病小鼠的調(diào)節(jié)作用及分子機制，以期為治療銀屑病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級雄性8～12周的BALB/C小鼠，每組6只。許可證號：SYXK（京）2016-0006，醫(yī)學(xué)實驗動物合格證書編號：11400700294421。實驗期間小鼠飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)動脈粥樣硬化研究所實驗動物中心標(biāo)準(zhǔn)動物房，12 h晝夜交替，室溫24±2℃，空氣濕度50%±10%，小鼠均可自由進(jìn)水進(jìn)食。實驗前動物先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有實驗均獲得山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物保護(hù)委員會批準(zhǔn)。動物實驗步驟按照《山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑與儀器 5%咪喹莫特乳膏（imiquimod cream，IMQ）購自四川明欣藥業(yè)有限公司；LM系列氫氣發(fā)生器購自濟(jì)南格潤實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銀屑病小鼠模型制備［4］BALB/C小鼠20只，隨機分為富氫鹽水組和生理鹽水組，每組各10只，兩組間小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腹腔注射富氫鹽水和生理鹽水7 d后，背部給予5%的咪喹莫特乳膏的同時，繼續(xù)給予富氫鹽水及生理鹽水腹腔注射7 d。通過腹腔注射4%水合氯醛（0.1 mL·kg-1）麻醉兩組小鼠后，將其背部約2 cm×2 cm毛發(fā)剃除后給予5%咪喹莫特62.5 mg·d-1，每天1次外涂。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠。取背部約1 cm×1 cm大小皮膚組織，4%多聚甲醛固定，按常規(guī)制成蠟塊，切片，HE染色，另外，部分背側(cè)皮膚在液氮中速凍，使用前在-80℃下保存。

1.2.2 富氫鹽水的制備 常溫常壓下，將500 mL生理鹽水，抽出200 mL生理鹽水的同時抽出全部氣體，LM系列氫氣發(fā)生器制備氫氣，將氫氣充入其中，直至水中含氫氣805μmol·L-1，達(dá)到飽和狀態(tài)。

1.2.3 組織學(xué)評估 采用改良TLPSS對動物的疾病臨床參數(shù)進(jìn)行獨立評分，其中包括評分、紅斑、厚度在0～4分的累積評分，其中4分代表最嚴(yán)重程度。將上述3種不同的評估結(jié)果相加，總得分為0～12分?？傮w來說，0代表無改變，1～4分別代表0～25%，25%～50%，50%～75%，75%～100%［5］。所有樣本均按Baker評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Munro膿腫、表皮延長、角化不全、角化過度、乳頭上部變薄、棘層肥厚、缺乏顆粒層、真皮乳頭毛細(xì)血管擴(kuò)張、淋巴細(xì)胞浸潤［6］。石蠟切片（5μm）用抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（Santa Cruz公司）染色。顯微鏡（奧林巴斯）采集圖像。

1.2.4 炎癥指標(biāo)的表達(dá) 實時定量熒光PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）在用光譜學(xué)進(jìn)行質(zhì)量檢查之后，使用TRIZOL（Invitrogen公司）分離背部皮膚中的總細(xì)胞RNA。隨后用QuantScript RT試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，將分離到的mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用SYBR-green PCR主混合試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH作為對照。表1列出了qRT-PCR中使用的所有引物。采用Rotor-gene Q software version 1.7（Qiagen公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2-ΔΔCt法檢測mRNA表達(dá)。采用ELISA試劑盒（Blue gene公司）測定血漿及組織中IL-1、IL-6、IL-17A和TNF-α水平。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所），采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substance assay，TBARS）測定血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平［7］。測定血漿氧磷酶-1（plasma paraoxonase-1，PON-1））的活性［8］。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。本研究在兩組的比較中應(yīng)用了Student'st檢驗，在異常分布數(shù)據(jù)中使用了非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗（雙尾），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的臨床及組織病理學(xué)表現(xiàn)

如圖1所示咪喹莫特誘導(dǎo)的兩組小鼠的臨床表現(xiàn)均符合銀屑病的臨床表現(xiàn)，且富氫鹽水組小鼠的背部皮膚紅斑、增生和鱗屑表現(xiàn)比鹽水組小鼠更少；富氫鹽水組小鼠的TLPSS評分低于生理鹽水組小鼠。HE染色顯示，兩組的H&E切片顯示表皮增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤，均符合銀屑病的病理表現(xiàn)。富氫鹽水組小鼠的組織病理學(xué)改變較生理鹽水組小鼠減輕（圖2）。與生理鹽水組小鼠相比，富氫鹽水組小鼠的組織病理學(xué)評分更低。結(jié)果提示富氫鹽水可以改善銀屑病的臨床和組織學(xué)表現(xiàn)。

圖1 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠背部皮膚的臨床表現(xiàn)及評分Fig.1 Clinical manifestations and scores of imiquimod-induced psoriasis in mice

圖2 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠背部皮膚組織病理學(xué)評分Fig.2 Histopathological and score of the back skin in imiquimod-induced psoriasis mice

2.2 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的炎癥因子的表達(dá)

本研究檢測了皮膚組織中炎癥因子的水平，包括IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α以評估咪喹莫特介導(dǎo)的皮膚炎癥。富氫鹽水組小鼠血漿中IL-1β、IL-6和IL-17A的表達(dá)（圖3），以及皮膚組織中IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α的表達(dá)均低于生理鹽水組小鼠（P＜0.05）。與生理鹽水組小鼠相比，富氫鹽水組小鼠的IL-1β、IL-6和IL-17A mRNA水平下降（圖4）。然而，與生理鹽水組小鼠相比，富氫鹽水組小鼠中血漿TNF-α（圖3）及其mRNA（圖4）水平均低表達(dá)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。結(jié)果提示富氫鹽水可以減輕銀屑病的炎癥反應(yīng)。

圖3 咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠皮膚組織和血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.3 Cytokine expression in the plasma and skin of psoriasis mice induced by imiquimod

圖4 咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠背部皮膚細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)Fig.4 Cytokine mRNA expression in the back skin of psoriasis mice induced by imiquimod

2.3 咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠氧化應(yīng)激的評估

本研究檢測了咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠血漿氧化指標(biāo)MDA水平以及PON-1的活性，以評估咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的氧化程度。富氫鹽水組MDA水平低于生理鹽水組，而富氫鹽水組PON-1活性高于生理鹽水組（P＜0.05，圖5）。結(jié)果提示富氫鹽水可以減輕銀屑病的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激因子的表達(dá)Fig.5 Oxidative stress factor expression in the back skin of psoriasis mice induced by imiquimod

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，不僅累及皮膚，還與脂代謝異常、心腦血管疾病成為共患病。氧化應(yīng)激和炎癥在銀屑病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，這一點也已經(jīng)得到了一些研究的證實［9］，同時可以認(rèn)為抗氧化和抗炎癥也是臨床治療銀屑病的重要靶點。盡管常規(guī)藥物對銀屑病患者有利，但各種耐藥和副作用增加了治療的難度。因此，臨床一直在尋求更好的治療銀屑病的方法。氫分子具有抗氧化、抗炎癥和抗凋亡的特性，同時又無明顯不良反應(yīng)，已經(jīng)被探索為許多疾病的理想治療工具。比如可以改善2型糖尿病、慢性肝炎、急性氧化應(yīng)激、腦中樞的缺血再灌注損傷等［10-12］。最新的研究表明富氫水對于銀屑病及銀屑病關(guān)節(jié)炎［13］、燒傷所致的面部色素沉著、放射性皮膚損傷、褥瘡以及高原皮膚病均有較好的治療效果［14-16］。同時在動物實驗中，對于大鼠的紫外線B輻射、糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面、犬皮膚傷口愈合、大鼠顎區(qū)皮膚創(chuàng)傷、特應(yīng)性皮炎中也取得了積極的治療效果［17-18］。

早在2015年日本學(xué)者就已經(jīng)評估了氫氣對銀屑病相關(guān)關(guān)節(jié)炎和皮膚病變的改善作用［3］。研究表明給予靜脈滴注、口服富氫水或吸入氫氣，均可以使銀屑病的嚴(yán)重程度評分下降，且降低炎癥因子IL-6和TNF-α的水平。復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院研究表明每周進(jìn)行兩次氫水浴，每次10～15 min，8周后，可以顯著改善銀屑病患者的皮損嚴(yán)重程度指數(shù)，同時可以緩解瘙癢癥狀［13］，從臨床的角度證實了富氫水對于銀屑病的治療作用，但是尚無富氫水在銀屑病小鼠模型中的相關(guān)研究。

銀屑病作為慢性炎癥性免疫性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿銀屑病的發(fā)生全程。眾多的炎癥因子在銀屑病患者或銀屑病小鼠模型的局部皮膚及血液中呈現(xiàn)出TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子的高表達(dá)［19］。咪喹莫特是TLR7/TLR8的配體，作為一種免疫和炎癥反應(yīng)的激活劑，其誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型已被廣泛應(yīng)用于銀屑病的研究。與銀屑病的發(fā)病機制類似，咪喹莫特介導(dǎo)的銀屑病小鼠模型是基于IL-23/IL-17軸的。IL-23可以通過刺激銀屑病病灶內(nèi)生成大量的角質(zhì)形成細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而活化Th17細(xì)胞，從而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌大量的炎癥因子IL-17A、IL-17F和IL-22［20］，IL-17A又可以募集中性粒細(xì)胞到銀屑病的皮損組織中［21］，IL-6既可以增強中性粒細(xì)胞募集，也可以增強角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖［22］。在銀屑病早期，樹突狀細(xì)胞可以產(chǎn)生TNF-α，而角質(zhì)細(xì)胞又產(chǎn)生IL-1β和TNF-α來激活樹突細(xì)胞［23］。IL-6和IL-1β則聯(lián)合驅(qū)動CD4+細(xì)胞向Th17細(xì)胞亞型［24］分化。咪喹莫特可以通過刺激樹突細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-1這些細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖，進(jìn)而阻礙角質(zhì)形成細(xì)胞的分化［25］。這些炎癥因子也同樣參與了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的發(fā)生、發(fā)展。因此，本研究對這些細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中，與生理鹽水組相比，富氫鹽水組病變組織中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17表達(dá)及血漿中組織中IL-1、IL-6、IL-17水平明顯下降，且富氫鹽水組小鼠皮膚組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17 mRNA水平明顯低于生理鹽水小鼠。與之前的人群試驗結(jié)果中炎癥因子的表達(dá)具有一致性［3］。研究結(jié)果表明富氫鹽水可以降低銀屑病的炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激為細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和抗氧化防御機制的失衡，會導(dǎo)致皮膚脂質(zhì)的氧化損傷和屏障蛋白完整性的破壞［26］。氧化代謝產(chǎn)物的增加以及機體抗氧化能力的下降在銀屑病中起到重要作用［27］。早期和活動期的銀屑病皮疹主要表現(xiàn)為滲透到表皮內(nèi)的多核白細(xì)胞激活導(dǎo)致NADPH氧化酶和蛋白水解酶產(chǎn)生ROS。氧化應(yīng)激反應(yīng)中的ROS在銀屑病中發(fā)揮關(guān)鍵作用［28］。通過觀察丙二醛（MDA）及對氧磷酶（PON-1）活性的方法檢測活性氧的水平，我們的前期研究表明，尋常型銀屑病患者血漿MDA表達(dá)顯著升高［26］。銀屑病患者血漿PON-1活性降低且與銀屑病患者的皮損面積及嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）評分呈負(fù)相關(guān)［30］。研究證實了氫氣的抗氧化作用，通過靜脈注射給予氫氣生理鹽水，發(fā)現(xiàn)急性腎臟缺血再灌注動物血漿中的MDA水平明顯降低，證明了富氫鹽溶液能夠通過對抗氧化應(yīng)激減輕腎臟缺血再灌注引起的氧化損傷［31］。與其他抗氧化劑相比，氫氣分子具有由于分子量小、穿透性強、可直接分散到細(xì)胞甚至細(xì)胞器中的特點。我們發(fā)現(xiàn)富氫鹽水組的MDA水平明顯低于生理鹽水組，而富氫鹽水組PON-1的活性遠(yuǎn)高于生理鹽水組。結(jié)果表明富氫鹽水可以通過抗氧化作用改善銀屑病的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，富氫鹽水明顯改善了咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的臨床及病理表現(xiàn)，這可能與降低了銀屑病的炎癥反應(yīng)和氧化指標(biāo)有關(guān)。由于本研究樣本量較小，潛在的重要變化可能會被忽略，因此，本實驗還存在一定的局限性。另外，本研究只選擇了一種給氫方式，未來可以比較不同途徑和方法給予氫對銀屑病的影響。綜上，體外補氫可能是未來治療和輔助改善銀屑病病理表現(xiàn)的一種潛在方法。