發(fā)酵類食品中微生物鑒定方法及功能研究進(jìn)展

于 堅(jiān)，孫嘉笛，孫秀蘭，黃耀光，黃鶴陽(yáng)，劉忠思，張銀志，紀(jì) 劍,

（1.江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214100；2.衛(wèi)龍生物技術(shù)有限公司，河南漯河 462000）

發(fā)酵類食品是我國(guó)一類具有悠久歷史文化的食品，是我國(guó)早期勞動(dòng)人民合理使用微生物資源的智慧的結(jié)晶，最早可起源于中國(guó)明代。最初的發(fā)酵類食品致力于改善食品的原有風(fēng)味，從而獲得更好的食用體驗(yàn)。然而，隨著發(fā)酵工藝條件的不斷進(jìn)步，以及針對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的微生物種類的研究不斷深入，并且呈現(xiàn)了諸如功能性發(fā)酵食品的新趨勢(shì)。而在這其中微生物的作用不可忽視。因此發(fā)酵類食品中的微生物研究具有重大的意義。

我國(guó)有較多使用微生物作為媒介發(fā)酵形成的傳統(tǒng)食品[1]。其中臭豆腐是最為著名的一種。它是將塊狀的豆腐浸泡在鹵水中達(dá)數(shù)小時(shí)或幾天發(fā)酵后制成的食品。制作臭豆腐的鹵水是以一些香辛料、竹筍、蔬菜、豆腐花、豆豉等植物為原料，并經(jīng)過(guò)微生物自然發(fā)酵作用形成。臭豆腐因發(fā)酵工藝和地域的細(xì)微差異分為南豆腐和北豆腐。北方王致和臭豆腐主要采用深度發(fā)酵，南方臭豆腐需要先制作鹵水后再將豆腐進(jìn)行淺度發(fā)酵。此外，腐乳也是一種非常重要的發(fā)酵類食品。腐乳中含有的氨基酸具有促進(jìn)脂肪代謝，控制人體膽固醇含量，控制血壓，抑制腫瘤生長(zhǎng)，防止心腦血管疾病的發(fā)生等的作用[2]，并且具有較高的食用價(jià)值，食物材質(zhì)結(jié)構(gòu)類似于干酪，獲得了“東方奶酪”的美稱[3]。

其中，微生物的種類和含量對(duì)于發(fā)酵類食品的風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有非常重大的影響。此外，發(fā)酵的溫度、pH 和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)等因素都可能會(huì)對(duì)發(fā)酵相關(guān)的微生物的存在與發(fā)酵能力產(chǎn)生較大的影響[4]。同時(shí)，鹵水中的微生物可能會(huì)產(chǎn)生多種對(duì)人體有益的代謝物，例如氨基酸、抗氧化因子等。目前，許多研究者針對(duì)發(fā)酵食品工藝中常用微生物進(jìn)行了非常深入的研究，該類微生物逐漸成為了傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的研究重點(diǎn)[5-6]。因此，對(duì)于臭豆腐等發(fā)酵類食品中新型微生物的分離，分析與風(fēng)味的關(guān)系，深入探究并開發(fā)新型的微生物功能性物質(zhì)，對(duì)于未來(lái)改良開發(fā)新型風(fēng)味與新型功能性鹵水，并提高我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的創(chuàng)新能力，具有非常重要的意義。

1 發(fā)酵食品中微生物的分離與鑒定方法

此前針對(duì)于發(fā)酵食品中常見的微生物種屬的鑒定方法主要是純培養(yǎng)分離方法。但是，隨著新興的高科技技術(shù)如生物信息技術(shù)和生物分子技術(shù)的普及，高效的PCR-DGGE 技術(shù)和高靈敏度的高通量測(cè)序技術(shù)開始出現(xiàn)在微生物的鑒定領(lǐng)域。

1.1 純培養(yǎng)分離

純培養(yǎng)分離方法是根據(jù)可能的微生物去遴選可能合適的培養(yǎng)基進(jìn)行菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，再通過(guò)微生物的生理生化及形態(tài)特征進(jìn)行菌落挑取后純化并進(jìn)行菌種鑒別的一種發(fā)酵食品微生物的研究方法。常常用于當(dāng)研究對(duì)象中存在多種菌落時(shí)使用，是一種最為常見且簡(jiǎn)便的微生物研究方法。孫貴朋[7]用純培養(yǎng)方法對(duì)從發(fā)酵鹵水中分離到的6 株高純度細(xì)菌，其中的5 種菌屬于芽孢桿菌的類別，而其中的1 株屬于魯氏不動(dòng)桿菌。翁美芝等[8]采用平板接種分離法對(duì)發(fā)酵淡豆豉中產(chǎn)纖溶酶微生物進(jìn)行篩選，得到了枯草芽孢桿菌等三種不同的細(xì)菌。張煜坤等[9]采用濃度梯度稀釋法及平板涂布法分別對(duì)3 種神農(nóng)架豆豉樣品中微生物進(jìn)行分離鑒別，分離出不同形態(tài)的單菌落，然后將獲得的分離菌落進(jìn)行DNA 測(cè)序最終得到4 株枯草芽孢桿菌屬的4 個(gè)亞種。

1.2 PCR-DGGE 技術(shù)

梯度凝膠電泳（DGGE）是一種基于生物信息學(xué)和分子生物學(xué)兩種學(xué)科作為理論基礎(chǔ)的生命科學(xué)鑒定。采用在一般電泳實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA 片段在不同濃度的變性劑溫度中雙鏈結(jié)構(gòu)解螺旋后片段大小的不同，將片段堿基組成相異，但是大小接近的片段進(jìn)行分離，并經(jīng)過(guò)官方常用的包含生物信息的數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)后，獲得微生物的遺傳學(xué)信息。Tanaka 等[10]采用該項(xiàng)技術(shù)研究了豆醬生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落的組成，細(xì)菌DGGE 圖譜表明醬油在微生物反應(yīng)過(guò)程中主要起作用的是乳桿菌屬、發(fā)酵乳桿菌等。燕平梅等[11]采用該項(xiàng)技術(shù)分析散裝泡菜、白菜泡菜、泡酸菜3 種不同泡菜中酵母菌多樣性，并鑒定出多種類型的酵母菌。另外，目前也有研究者將PCR-DGGE 技術(shù)應(yīng)用到水果酵素發(fā)酵相關(guān)的微生物菌群分析，能夠檢測(cè)出培養(yǎng)基中致病菌類[12]。

1.3 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序（HTS），也可叫做二代基因檢測(cè)，在使用過(guò)程中可以產(chǎn)生多種基因信息。該項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)篩選多個(gè)不同的基因組區(qū)域，準(zhǔn)確的識(shí)別出樣品中絕大多數(shù)的微生物類群，包括不能在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)的，以及豐度較低的菌類[13]。HTS 包括ABI SOLiD連接法測(cè)序、454 焦磷酸測(cè)序和Illumina Solexa 合成測(cè)序等。孫娜等[14]采用HTS 對(duì)發(fā)酵前期和發(fā)酵末期青腐乳鹵水中的微生物種類進(jìn)行分析。Ezeokoli等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)酵豆制品中的核心菌落，用16S rRNA 技術(shù)分析了7 個(gè)大豆發(fā)酵制品樣品中的DNA 序列。HTS 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于可以較為完整地獲取菌種的遺傳信息，通過(guò)例如NCBI 等大型生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)比較，可以較為準(zhǔn)確地獲知該種微生物的種屬名稱，對(duì)后續(xù)的微生物培養(yǎng)與特性研究給予一定的支撐。

2 發(fā)酵食品中的微生物種類分析

在發(fā)酵食品的鹵水制作時(shí)，微生物的種類選擇極其重要。并且此前的研究表明，鹵水中含有的微生物種類非常的豐富，不同的微生物在鹵水的發(fā)酵、氣味、功能性等方面起著重要的作用。鹵水中微生物在臭豆腐等豆類食品發(fā)酵過(guò)程中作用十分明顯，不僅能夠分解大豆中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，而且能夠參與風(fēng)味物質(zhì)的形成，有效提高大豆極其相關(guān)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分的分解與吸收。其中，在發(fā)酵類食品中含有的微生物主要為細(xì)菌、真菌兩大類，具體名稱如表1所示。

表1 發(fā)酵食品制作中的微生物Table 1 Microorganisms in the production of brine

2.1 細(xì)菌

細(xì)菌是一類非常常見的菌類，并且在中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中應(yīng)用非常廣泛，目前在發(fā)酵類食品的鹵水中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種類主要是球菌類和桿菌類。

2.1.1 球菌類 球菌一般為球狀或近球狀類型的細(xì)菌。根據(jù)顯微鏡下菌落排列數(shù)量以及方式的不同，區(qū)分為單、雙、鏈、四聯(lián)和八疊等[20]。趙國(guó)忠等[21]通過(guò)16S rRNA 測(cè)序方法鑒定了臭豆腐鹵水中的微生物種類，認(rèn)為臭豆腐鹵水中的主要細(xì)菌為漫游球菌（Vagococcus collins）、鳥腸球菌（Enterococcus），并且為臭豆腐的規(guī)范性制作提供了指導(dǎo)性建議。范博望等[22]通過(guò)對(duì)臭豆腐鹵水的稀釋分離，發(fā)現(xiàn)了臭豆腐鹵水中存在巴黎鏈球菌（Streptococcus lutetiensis）等球形細(xì)菌。此外，其研究發(fā)現(xiàn)，若采用相同的發(fā)酵條件，對(duì)單一菌和混合菌進(jìn)行鹵水發(fā)酵比較，單一菌經(jīng)過(guò)相同時(shí)間發(fā)酵后產(chǎn)生的鹵水感官評(píng)價(jià)不如混合菌株發(fā)酵出的鹵水優(yōu)越，進(jìn)一步證明了高質(zhì)量鹵水是混合發(fā)酵的結(jié)果。范洪臣等[23]也通過(guò)分離腐乳的發(fā)酵用醬料中的微生物獲取了多種如芽孢桿菌等多種微生物，并分析了最佳的配比方案。

2.1.2 桿菌類 桿菌是指形狀為圓柱，或者近卵圓形的菌株。根據(jù)堆積數(shù)量可分為單、雙、鏈、球、棒狀、分枝、雙歧桿菌等。Gu 等[24]采用二代測(cè)序方法，研究臭豆腐中微生物菌群的多樣性，乳桿菌屬是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的主要乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），臭豆腐中還具有鹽單胞菌屬等部分潛在有害細(xì)菌，提高了對(duì)臭豆腐中微生物的認(rèn)識(shí)。Xie 等[25]采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分型和16S rDNA 測(cè)序?qū)? 種發(fā)酵茶葉和醬油鹵水中分離到的168 個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)序。共鑒定出136 株代表菌株，有乳桿菌和魏氏桿菌等7 個(gè)屬32 個(gè)種。南曉芳[26]從9 個(gè)豆豉和腐乳樣品中共分離出31 株乳酸菌，篩選出5 株耐鹽乳桿菌，發(fā)現(xiàn)5 株菌對(duì)大腸桿菌等致病菌有較好的控制作用，并且都具有降解膽固醇的能力以及抗氧化能力。5 株菌株的有害產(chǎn)物檢測(cè)均呈陰性，并且均對(duì)抗生素敏感，是比較安全的菌株。

2.2 真菌

真菌是具真核、可產(chǎn)孢子且不具有葉綠體的真核菌類。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)中，常見的真菌類為各種酵母菌和一些少量的霉菌類。這些少量的真菌微生物可產(chǎn)酸產(chǎn)堿，代謝糖類物質(zhì)產(chǎn)生芳香醇類和芳香醛類物質(zhì)，使鹵水呈現(xiàn)足夠的風(fēng)味。

2.2.1 酵母類 酵母（Saccharomyces）是一種單胞菌，常常用于醬油、面團(tuán)等食品的發(fā)酵。常見的酵母菌有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、茶酵母和啤酒酵母等。王正莉等[27]在傳統(tǒng)發(fā)酵酒曲和豆豉類食品中分離得到了西弗漢遜氏酵母（Hansenula severus）、異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala）等10 多種真菌類微生物，并且根據(jù)風(fēng)味成分對(duì)其進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。此外，趙玲艷等[28]對(duì)鹽漬辣椒發(fā)酵過(guò)程中所參與的菌種進(jìn)行了種群樣品分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)真菌屬為畢赤酵母屬（Pichia pastoris）、異常漢遜氏酵母屬（Hansenula anomala）等。基于這一點(diǎn)，分析了鹽漬辣椒真菌菌落的多樣性，以及發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)以及相對(duì)豐度的變化，分析了多種微生物在發(fā)酵過(guò)程的風(fēng)味作用，對(duì)于新菌種資源的開發(fā)具有重要意義。

2.2.2 霉菌 以北方王致和臭豆腐為首的傳統(tǒng)發(fā)酵類食物中存在的霉菌類常見的為各種曲霉，此外還有常見的毛霉等。此類微生物可以在臭豆腐等豆制品表面形成堅(jiān)硬的外殼狀物質(zhì)，并代謝內(nèi)部的豆類蛋白等，分泌不同類型的氨基酸等。Qiu 等[29]從發(fā)酵豆豉產(chǎn)品中得到了一種食品級(jí)黑曲霉（Aspergillus niger），可以參與醬油、豆豉等食品的代謝，并對(duì)食品中的霉菌毒素具有一定的抑制作用。此外，高玉榮等[30]采用魯氏毛霉（Mucor roxianus）發(fā)酵后的豆制品分析了不同時(shí)間點(diǎn)的風(fēng)味變化?？偁蠲挂部梢栽诙蛊墒称返陌l(fā)酵過(guò)程中對(duì)食品本身風(fēng)味產(chǎn)生非常積極的影響。因此，霉菌類在發(fā)酵臭豆腐等食品的制作流程中是主要的發(fā)酵劑。

3 發(fā)酵食品中微生物的功能性分析及品質(zhì)風(fēng)味關(guān)系

發(fā)酵食品中含有許多功能型微生物，他們能夠通過(guò)分解原料中的大分子物質(zhì)，并產(chǎn)生大量的水解蛋白和游離氨基酸，以及大量的維生素類物質(zhì)[31]，主要可以形成發(fā)酵類食品的特殊腌漬風(fēng)味。此外，采用不同的菌種進(jìn)行發(fā)酵可以獲得多種功能的鹵水，如改善營(yíng)養(yǎng)組成、改善腸道菌群組成、減少食物中的抗?fàn)I養(yǎng)成分等，具體功能特性如表2所示。研究微生物在發(fā)酵類食品發(fā)酵流程中的所起到的作用，對(duì)于提高此類食品的風(fēng)味以及功能品質(zhì)具有重要意義。

表2 鹵水中不同微生物與功能Table 2 Different microorganisms and functions in brine

3.1 形成食品風(fēng)味

發(fā)酵類食品例如臭豆腐等的風(fēng)味主要是源于各種揮發(fā)類物質(zhì)，使得豆腐原材料中的蛋白、糖在自身內(nèi)源酶和微生物分泌酶系作用下形成大量酯類、醇類、含硫化合物等揮發(fā)性物質(zhì)，使得豆腐具有特殊的氣味[31]。氣味物質(zhì)所帶來(lái)的食品風(fēng)味是多種微生物聯(lián)合作用下產(chǎn)生的，并且在不同發(fā)酵時(shí)期風(fēng)味物質(zhì)也有一定的差異[31]。不同鹵水配方中微生物的種類也不盡相同，所形成的風(fēng)味物質(zhì)具有一定的差異，因此，發(fā)酵微生物在臭豆腐風(fēng)味物質(zhì)形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

李雨楓等[35]研究了臭豆腐鹵水在發(fā)酵時(shí)微生物種類和數(shù)量的變化及風(fēng)味成分分析，利用固相微萃取（SPME）聯(lián)合氣相質(zhì)譜（GC-MS）的方法（SPME-GCMS）檢測(cè)發(fā)酵完成的鹵水中存在的揮發(fā)性成分，并比較了它們的差異性。主要發(fā)現(xiàn)了吲哚等氣味物質(zhì)，其中明串珠菌屬和鹽厭氧菌屬與含硫化合物、吲哚有極大的關(guān)聯(lián)，是臭味的主要來(lái)源；乳桿菌屬、四聯(lián)球菌屬和酯類、酮類、醇類物質(zhì)的相關(guān)性最大，為臭豆腐提供香氣。鄧思敬等[36]利用實(shí)驗(yàn)室前期從自然發(fā)酵臭豆腐的剩余鹵水中得到的13 株乳酸菌，并從中篩選8 株活性優(yōu)良的菌種接種于生產(chǎn)配方中，經(jīng)過(guò)37 ℃發(fā)酵20 h 制得臭豆腐發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)GC-MS 鑒定得到61 種氣味性物質(zhì)，其香氣成分與市售發(fā)酵臭豆腐鹵水相仿。鄭小芬等[37]采用同樣的上述方法，分析了2 種不同臭豆腐所對(duì)應(yīng)的鹵水中氣味物質(zhì)的差異，采用歸一化法計(jì)算了其相對(duì)含量。根據(jù)微生物種類與氣味物質(zhì)之間的相關(guān)系數(shù)，并預(yù)測(cè)成分的變量重要性，還確定了芽孢桿菌、腸桿菌、乳桿菌、鞘氨酸桿菌、單胞菌、四基因球菌等9 種細(xì)菌和交鏈孢屬、雜交鏈霉屬、放線菌屬等6 種真菌是發(fā)酵過(guò)程中核心功能微生物[38]。

3.2 改善營(yíng)養(yǎng)組成

維生素B12是維持大腦關(guān)鍵功能的重要營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)于抑制抑郁癥、老年癡呆及貧血具有重要作用，腐乳中B 族維生素種類多樣，腐乳在發(fā)酵時(shí)經(jīng)過(guò)微生物的作用會(huì)產(chǎn)生維生素B12[38]。經(jīng)過(guò)魯氏毛霉、釀酒酵母等真菌類微生物發(fā)酵后，腐乳中含有大豆多肽和蛋白黑素，其中蛋白黑素具有強(qiáng)抗氧化性[39]。這些微生物所產(chǎn)生的大豆多肽等物質(zhì)具有抗高血壓、降血脂、抗氧化、提高免疫力、抗癌作用及緩解運(yùn)動(dòng)疲勞等多項(xiàng)功能[40]。另外，發(fā)酵過(guò)程中的酵母能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)、脂肪、糖類等生物大分子物質(zhì)分解為游離氨基酸、脂肪酸和葡萄糖等小分子物質(zhì)，在發(fā)酵時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些人體必需氨基酸。例如，陳嘉序等[41]通過(guò)對(duì)魏氏桿菌等微生物發(fā)酵的食品中的成分研究，發(fā)現(xiàn)雌馬酚和大豆異黃酮類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量出現(xiàn)了明顯的升高。這也表明微生物的發(fā)酵對(duì)于發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)成分的改善有一定的作用。

3.3 增強(qiáng)食品抗氧化作用

人體在新陳代謝中可能產(chǎn)生較多的自由基，過(guò)多自由基的生成會(huì)影響人體健康，導(dǎo)致人體衰老。臭豆腐在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大豆異黃酮、大豆多肽等抗氧化物質(zhì)，能夠延緩衰老，促進(jìn)人體健康。研究表明發(fā)酵食品中的微生物例如毛霉、曲霉等霉菌微生物可以產(chǎn)生具有增強(qiáng)食品的抗氧化的能力的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[42]。鄒磊等[43]分別接種兩種不同的毛霉制作了腐乳，并對(duì)其進(jìn)行自由基的去除、抑制油脂過(guò)氧化以及其還原能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，以此為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物的抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃色毛霉發(fā)酵產(chǎn)生的腐乳中具有更優(yōu)的抗氧化功能。王富豪等[44]提取了多個(gè)大豆品種里大豆異黃酮的含量，并對(duì)其對(duì)DPPH、ABTS 自由基去除水平進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)糖苷型異黃酮含量與DPPH 和ABTS 自由基去除水平有較高的線性相關(guān)性。董爽等[45]對(duì)魯氏毛霉促腐乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)含量變化進(jìn)行了研究，在豆腐坯上接種毛霉進(jìn)行發(fā)酵后，測(cè)定發(fā)酵腐乳在不同階段的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)隨著微生物分泌的酶的作用腐乳的抗氧化能力在前發(fā)酵期和水解階段快速上升，發(fā)酵后期上升較慢，在后酵期達(dá)20 d 時(shí)，腐乳的抗氧化能力達(dá)到最大值。

3.4 降血壓作用

血管緊張素Ⅱ是可以引起血壓升高的血管收縮劑。因此，抑制這些可以產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的酶的活性，以減少這種物質(zhì)的產(chǎn)生是用于控制高血壓的一個(gè)重要途徑。在腐乳生產(chǎn)過(guò)程中，某些生物活性肽能夠抑制血管緊張素Ⅱ催化酶的活性從而起到防止血壓升高的的作用，其中魯氏毛霉和乳酸桿菌的聯(lián)合發(fā)酵可以達(dá)到該種效果。Kuba 等[46]從魯氏毛霉和乳酸桿菌的聯(lián)合發(fā)酵的腐乳中分離到兩種具有抑制上述酶類活性的生物活性肽，其活性肽序列分別為Ile-Phe-Leu 和Trp-Leu。其中產(chǎn)生的γ-氨基丁酸（GABA）會(huì)結(jié)合神經(jīng)受體在腦血管中，能夠有效提升血管的擴(kuò)張能力，從而抑制血管血壓過(guò)高。

3.5 抑制抗?fàn)I養(yǎng)成分

大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因成分包括營(yíng)養(yǎng)抑制因子等熱敏性物質(zhì)以及植酸、寡糖、單寧、抗原蛋白等耐熱并抗維生素因子及其他化學(xué)成分[39]。在發(fā)酵豆制品中存在的部分微生物能夠降解大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，并將其轉(zhuǎn)化為被人體吸收的成分。例如從印度尼西亞的豆酵餅中發(fā)現(xiàn)的的寡孢根霉能夠降解引起胃脹氣的水蘇糖等物質(zhì)，以及甘油三酯等酯類，并使之降解成可供人體吸收分解的單糖和二糖[47]。

3.6 改善腸道菌群

腸道微生物與它們可以產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)人體健康和保持腸道中免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)具有巨大的功效。熊駿等[48]從傳統(tǒng)方法發(fā)酵制作而成的發(fā)酵類豆豉中分離出具有抑菌活性的乳酸菌，可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等，對(duì)廣譜的致病菌均可以產(chǎn)生較好的抑制效果。Lee 等[49]從韓國(guó)傳統(tǒng)醬油中分離篩選出3 株芽孢桿菌MKSK-E1、MKSK-J1 和MKSK-M1，并在模擬胃腸道環(huán)境條件下，證明了這3 株菌具有廣泛的抑菌活性。因此，這3 株菌對(duì)人體具有益生菌功能性，可以從發(fā)酵豆制品中分離出對(duì)人體有益的微生物，并制成相應(yīng)的益生菌產(chǎn)品。Yuan 等[50]研究發(fā)現(xiàn)在豬每日飼料中添加3.75%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的發(fā)酵豆粕和7.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大豆?jié)饪s蛋白，分別提高了38～68 d 的仔豬的養(yǎng)份消化率、糞便酶活性和乳酸菌數(shù)量，降低糞便中大腸桿菌數(shù)量，能夠有效改善豬腸道菌群組成。Yi 等[51]從臭豆腐鹵水中分離到一株居里乳桿菌CCTCC M2011381 在大豆分離蛋白、豆奶和銀杏飲料中的生長(zhǎng)20 h 后，該菌株的數(shù)量均增加。此外，根據(jù)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在所有發(fā)酵基質(zhì)中存活的菌株均能在小鼠腸道中存活。

3.7 抑制有害菌

臭豆腐鹵水在發(fā)酵產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的期間經(jīng)過(guò)益生芽孢桿菌、乳酸桿菌、鳥腸球菌等微生物的作用會(huì)產(chǎn)生大量的揮發(fā)性物質(zhì)[51]，具有延長(zhǎng)食品貨架期，增強(qiáng)食品安全品質(zhì)的作用。另一方面大豆中的物質(zhì)能夠被黑曲霉[52]、異常漢遜氏酵母[53]等真菌分解產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。在某些以根霉為發(fā)酵劑制成的發(fā)酵豆制品中，異黃酮對(duì)臘樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等能夠引起食物中毒和腐敗的致病微生物有較強(qiáng)的抑制作用。

3.8 吸附有害物質(zhì)

發(fā)酵食品中的微生物的另一個(gè)作用就是減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，例如鹵水中的乳酸菌能夠抑制不飽和脂肪酸的過(guò)氧化或減少來(lái)源于相應(yīng)醇類的醛[54]，部分乳桿菌能夠吸附食品中的真菌毒素，研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素的存在并不影響乳桿菌的生長(zhǎng)，3 株植物乳桿菌對(duì)黃曲霉毒素的吸收能力最強(qiáng)，對(duì)真菌毒素的結(jié)合率接近60%，而對(duì)ST 產(chǎn)毒菌株的結(jié)合率可達(dá)20%以上。乳酸菌還能夠吸附重金屬離子，如汞、鎘等。有研究表明，源自我國(guó)傳統(tǒng)泡菜的菌株Lb. plantarum 70810 EPS 在魚腸道環(huán)境中，當(dāng)pH5.0 且溫度為30 ℃時(shí)，該菌株6 h內(nèi)的對(duì)鉛的吸附能力可達(dá)160.62 mg/g，傅立葉變換紅外光譜表明，參與吸附的是-OH、-NH和COO-等官能團(tuán)[55]。He 等[54]分離出了一株醬油中的食品級(jí)黑曲霉，發(fā)現(xiàn)該種菌株可以抑制醬油等發(fā)酵食品中玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素的產(chǎn)生。徐智虎等[56]分離出了貴州傳統(tǒng)的發(fā)酵類食品中的乳酸桿菌，并進(jìn)行了性質(zhì)探究，發(fā)現(xiàn)此類乳酸桿菌具有較好的吸附生物胺等有害物質(zhì)的能力。因此，在發(fā)酵食品中，微生物除了可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味外，還具有減少有害物質(zhì)生成的作用。

4 挑戰(zhàn)與展望

4.1 特殊風(fēng)味臭鹵水發(fā)酵存在的挑戰(zhàn)

微生物已被證明是豐富的自然資源，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用最廣。以臭豆腐為主的發(fā)酵類食品十分需要微生物的發(fā)酵，采用多樣的微生物對(duì)食品進(jìn)行混合發(fā)酵，可以較大程度上賦予食品一定的風(fēng)味特性以及功能特性。因此，必須重視對(duì)已有的鹵水中存在的微生物種類及其功能探究。

此外，在鹵水發(fā)酵過(guò)程中，由于發(fā)酵條件的簡(jiǎn)陋以及發(fā)酵前期的衛(wèi)生措施簡(jiǎn)陋，時(shí)常存在著一些有害微生物，其能夠產(chǎn)生生物胺，對(duì)人體健康造成威脅，如有害霉菌、蠟樣芽孢桿菌等[57]。

4.2 下一步的研究展望

未來(lái)更應(yīng)該以臭豆腐鹵水中的微生物作為重要的研究對(duì)象，探究鹵水發(fā)酵過(guò)程中各種微生物菌群的特性，控制致病菌繁衍，減少有害物質(zhì)的出現(xiàn)，促進(jìn)有益產(chǎn)物的產(chǎn)生。合理利用臭豆腐鹵水中的微生物資源，分離發(fā)酵期間產(chǎn)生的對(duì)人體有益的微生物，并將其作為益生菌資源，減少益生菌資源的浪費(fèi)，開發(fā)既有有益菌的發(fā)酵劑又能減少有害菌的數(shù)量的混合發(fā)酵劑，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。研究鹵水發(fā)酵的過(guò)程中所出現(xiàn)的不同微生物的作用，開發(fā)不同種類的鹵水，制作工業(yè)化鹵水微生物生產(chǎn)發(fā)酵劑，為發(fā)酵食品逐步走向工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化提供一定的參考。鹵水中微生物多樣，研究微生物之間的生物化學(xué)作用，對(duì)于提高發(fā)酵類型食品的品質(zhì)具有巨大的戰(zhàn)略意義。