9 種腹瀉性貝類毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法的建立

王 婷，梁 瓊，趙曉野，王 儒

（海南省食品藥品檢驗(yàn)所海口分所，海南?？?570311）

海洋生物毒素是一類存在于海洋生物體內(nèi)的特殊高活性代謝產(chǎn)物，多存在于貝類及西甲魚類中，其生物結(jié)構(gòu)為生物堿和多肽，按其毒素毒性作用機(jī)制可分為麻痹性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素、失憶性貝類毒素及神經(jīng)性貝類毒素。其中腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP）是一類大環(huán)內(nèi)酯或聚醚的脂溶性化合物，主要是由原甲藻類和鰭藻等藻類產(chǎn)生[1-4]。DSP 毒素包括：米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine，GYM）、螺環(huán)內(nèi)酯毒（Spirolides，SPXs）、軟海棉酸毒素（Okadaic acid，OA）及其衍生物鰭藻毒素（Dinophys-istoxin，DTX 毒素）、聚醚類毒素，如原多甲藻酸（Azaspir acid，AZAs），蛤毒素（Pectonotoxin，PTXs）和蝦夷扇貝毒素[5-6]。貝類等慮食性動(dòng)物通過(guò)濾食有毒藻類而使得DSP 在體內(nèi)富集，危害食用者健康。當(dāng)人們誤食染毒的貝類后就會(huì)造成中毒，癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉，與一些普通腹瀉癥狀相似，所以往往被人們忽視[7-8]。DSP 在全球沿岸海域均有分布，是世界范圍內(nèi)具有最嚴(yán)重威脅的赤潮藻毒素之一。由于腹瀉性貝類中毒現(xiàn)象普遍存在，且分布較廣、致毒性強(qiáng)，故被列為世界食品衛(wèi)生學(xué)重要問(wèn)題之一。

目前貝類毒素檢測(cè)方法有小鼠生物測(cè)定法（MBA 法）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELASA）法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）等[9-14]。雖然MBA 法是腹瀉性貝類毒素最普遍的檢測(cè)方法，但該方法需大量使用小鼠，不符合“3R”的要求[15]，而且靈敏度低、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差，具有易出現(xiàn)假陽(yáng)性和無(wú)法確定毒素的成分、結(jié)構(gòu)和含量等缺點(diǎn)；ELASA 試劑盒雖靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，但其試劑盒昂貴，也有因類似物干擾作用，出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況[16]，不適合日常監(jiān)測(cè)使用；高效液相色譜-熒光法是國(guó)內(nèi)外目前常用的貝類毒素檢測(cè)方法，但是分析過(guò)程中使用的柱衍生試劑如ADAM 價(jià)格昂貴[17]，背景干擾對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大，操作繁瑣，重復(fù)性差，因此其應(yīng)用受到一定的限制；HPLC-MS/MS 測(cè)定是近年興起的一種檢測(cè)技術(shù)，比其他方法重復(fù)性好，不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，是一種能夠準(zhǔn)確定性定量，并能夠提供準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu)信息的新型分離技術(shù)[18]。在眾多的分析測(cè)試方法中，HPLC-MS/MS 以其同時(shí)具備高特異性和高靈敏度的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物毒素研究領(lǐng)域。

此次研究以可食用新鮮貝類為研究對(duì)象，針對(duì)其中可能存在脂溶性貝類毒素的污染情況，開發(fā)了適用于腹瀉性貝類毒素的檢測(cè)方法，通過(guò)快速、高效的QuEChERS 和分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化，建立HPLC-MS/MS 法對(duì)9 種腹瀉性貝類毒素進(jìn)行定性和定量測(cè)定，以獲得快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，為不安全貝類產(chǎn)品及其制品的毒素檢測(cè)提供依據(jù)，為監(jiān)管部門提供可靠的技術(shù)支撐和參考價(jià)值，保障廣大消費(fèi)者的生命健康安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菲律賓蛤仔、魁蚶、櫛江珧、波紋巴非蛤、華貴櫛孔扇貝、裂紋格特蛤、翡翠貽貝、鈍綴錦蛤、方斑東方螺、蟶子等，分別于海南省?？谑?、文昌市、瓊海市、三亞市、儋州市、東方市五個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行采樣；甲醇、乙腈、正己烷、二氯甲烷 均為色譜純，德國(guó)默克公司；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純，廣州化工；甲酸 色譜純，美國(guó)ACS 公司；乙酸銨 色譜純，美國(guó)Fisher 公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：大田軟海綿酸（Okadaic acid, OA）：8.4±0.4 μg/mL，鰭藻毒素1（Dinophys-istoxin, DTX1）：8.5±0.7 μg/mL，鰭藻毒素2（Dinophys-istoxin, DTX2）：3.83±0.25 μg/mL，扇貝毒素2（Pectonotoxin, PTX2）：4.4±0.13 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素1（Azaspir acid,AZA1）：1.3±0.07 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素2（Azaspir acid, AZA2）：1.22±0.06 μg/mL，原多甲藻酸貝類毒素3（Azaspir acid, AZA3）：1.18±0.25 μg/mL，米氏裸甲藻毒素（Gymnodimine, GYM）：2.5±0.13 μg/mL，螺環(huán)內(nèi)酯毒素1（Spirolides, SPX1）：7.25±0.3 μg/mLNRC，加拿大海洋研究中心。

LC 1290-MS 6460 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Multi Reax（EU）渦旋振蕩器德國(guó)海道爾夫（Heidolph）公司；MS3 D S025 渦旋儀德國(guó)IKA 儀器設(shè)備有限公司；舒美KQ-50 超聲儀昆山儀器；3-18K 離心機(jī) 德國(guó)SIGMA 公司；TTLDCII 氮吹儀 同泰公司；MSE125P-CE（感量為0.00001 g）天平 德國(guó)Sartorius 公司；PL602-L 天平（感量為0.01 g） 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q IQ7000 超純水系統(tǒng) 美國(guó)默克密理博公司；Prime HLB 固相萃取小柱（6 cc，200 mg）、MCX 混合型陽(yáng)離子柱（6 cc，200 mg）、C18固相萃取柱（6 cc，200 mg）美國(guó)Waters 公司；C18粉美國(guó)Agela 公司；腹瀉性貝類毒素免疫親和柱（3 mL） 美正生物。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確量取一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，用乙腈配制成1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取1 mL 儲(chǔ)備液，用乙腈定容至10 mL，得到100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液。稱取陰性空白樣品，按照前處理過(guò)程處理樣品，得到空白基質(zhì)。取一定量標(biāo)準(zhǔn)使用液，用空白基質(zhì)配制成濃度梯度為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線[19-22]。

1.3 樣品制備

樣品用清水洗凈外部泥沙，去殼取出貝肉，再將貝肉用超純水清洗干凈，瀝干水分，將樣品剪碎后用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)備用。樣品制備完成后，放置-20 ℃冷凍儲(chǔ)存，測(cè)定前將其室溫解凍。

1.4 樣品處理方法

樣品經(jīng)80%乙腈水提取，利用QuEChERS 和分散固相萃取技術(shù)進(jìn)行凈化，具體操作如下：稱取2.00 g 樣品，加入10 mL 80%乙腈水溶液，再加入1 g 無(wú)水硫酸鎂和0.5 g 氯化鈉，渦旋振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，取上清液40 ℃氮吹近干，甲醇定容至1 mL，再加入125 μL 氫氧化鈉溶液（2.5 mol/L），于76 ℃下溫育40 min 后冷卻至室溫，再加入125 μL 鹽酸溶液（2.5 mol/L），所得水解液中加入0.05 g C18粉和0.1 g 無(wú)水硫酸鎂，渦旋振蕩，5000 r/min 離心5 min，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 分析條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A相為5 mmol/L 乙酸銨0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速：0.3 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：AJS ESI；掃描方式：Positive/Negative；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：4000 V；霧化器壓力：35 psi；離子源溫度：300 ℃；氮?dú)庾鳛榍蕷夂团鲎矚?，其中鞘氣?1.5 L/min，輔助氣為1.65 L/min。各組分監(jiān)測(cè)的MRM 參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 MRM 參數(shù)Table 2 MRM parameters

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，根據(jù)目標(biāo)物所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各目標(biāo)化合物的線性范圍、檢出限。同時(shí)稱取空白樣品進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品做6 個(gè)平行樣，計(jì)算目標(biāo)物的回收率和精密度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本文圖譜采用安捷倫Qualitative Analysis B.07.00＞繪制。數(shù)據(jù)處理采用安捷倫QQQ Quantitative Analysis 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算、信噪比計(jì)算。提取液選擇中的回收率的計(jì)算、不同凈化方法回收率的計(jì)算均采用兩個(gè)平行樣品取平均值計(jì)算。精密度選擇三個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度取連續(xù)采集6 針數(shù)據(jù)的峰面積進(jìn)行相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值的計(jì)算。方法檢出限按照檢出限公式：檢出限=3×對(duì)照品濃度×樣品稀釋體積/信噪比/取樣量，計(jì)算出目標(biāo)物檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)9 種DSP 的分子量以及化學(xué)電離性質(zhì)，分別在正、負(fù)離子掃描模式下進(jìn)行母離子全掃描，篩選相應(yīng)較高的離子對(duì)。對(duì)目標(biāo)物濃度為1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行一級(jí)離子掃描，掃描結(jié)果顯示OA、DTX-1、DTX-2 在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高，其余化合物在正離子模式下響應(yīng)更優(yōu)。在獲得分子離子峰后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描，對(duì)Fragmentor 電壓和碰撞能（Collision Energy）等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到表2 的質(zhì)譜參數(shù)。在該儀器條件下對(duì)濃度為50 ng/mL 的9 種DSP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，單個(gè)物質(zhì)色譜圖如圖1～圖9所示，9 種DSP 總離子流圖如圖10所示，所有物質(zhì)均在9 min 前完成出峰，響應(yīng)值均在103以上。

圖1 大田軟海綿酸色譜圖Fig.1 Acid chromatogram of okadaic acid

圖2 鰭藻毒素1 色譜圖Fig.2 Acid chromatogram of dinophysistoxin-1

圖9 螺環(huán)內(nèi)酯毒素1 色譜圖Fig.9 Acid chromatogram of spirolides

圖3 鰭藻毒素2 色譜圖Fig.3 Acid chromatogram of dinophysistoxin-2

圖4 扇貝毒素2 色譜圖Fig.4 Acid chromatogram of pectonotoxin-2

圖5 原多甲藻酸貝類毒素1 色譜圖Fig.5 Acid chromatogram of azaspir acid-1

圖6 原多甲藻酸貝類毒素2 色譜圖Fig.6 Acid chromatogram of azaspir acid-2

2.2 液相條件優(yōu)化

DSP 屬于親脂性海洋生物毒素，在理化性質(zhì)方面呈現(xiàn)多樣性，如其含有羧酸、磺酸、氨基和亞氨基官能團(tuán)[23-28]。DSP 毒素有一定的復(fù)雜性，根據(jù)碳骨架結(jié)構(gòu)將這些成分分為酸性成分、中性成分以及堿性成分[29-30]。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中流動(dòng)相選擇、樣品前處理和凈化洗脫都要考慮到目標(biāo)物的屬性。

圖7 原多甲藻酸貝類毒素3 色譜圖Fig.7 Acid chromatogram of azaspir acid-3

圖8 米氏裸甲藻毒素色譜圖Fig.8 Acid chromatogram of gymnodimine

2.2.1 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)采用了比較常見(jiàn)的C18反相色譜柱。研究比較了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離效果的差異[31]。比較圖10 和圖11 發(fā)現(xiàn)，C18分離效果相較T3柱更好，因此選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18的液相色譜柱對(duì)其余毒素進(jìn)行采集分離。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)C18柱不僅對(duì)軟海棉酸（OA）類毒素的分離效果好，對(duì)其他DSP 也能夠完全分離，沒(méi)有毛峰，而且靈敏度也較高，滿足實(shí)驗(yàn)需要。

圖10 C18 柱分離9 種DSP 混合物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.10 Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on C18 column（50 ng/mL）

圖11 T3 柱分離9 種DSP 混合物總離子流圖（50 ng/mL）Fig.11 Total ion flow diagram of separation of 9 DSP mixtures on T3 column（50 ng/mL）

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 因DSP 是一種脂溶性物質(zhì)，且9 種目標(biāo)物中存在酸性成分、中性成分和堿性成分。根據(jù)其不同的性質(zhì)以及9 種目標(biāo)物在質(zhì)譜上正、負(fù)離子不同掃描模式不同，在流動(dòng)相中添加甲酸，使得H+濃度增加，增強(qiáng)離子化效率，在正離子掃描模式下提高響應(yīng)；同時(shí)在流動(dòng)相中添加弱堿性的緩沖鹽溶液，增強(qiáng)分離度，提高負(fù)離子掃描模式下的響應(yīng)。所以選擇5 mmol/L 乙酸銨水溶液（加0.1%甲酸）和乙腈為流動(dòng)相，通過(guò)改變流動(dòng)相的比例對(duì)DSP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，最終采用梯度洗脫方法將9 種DSP 毒素完全分開，并且靈敏度較高，峰形尖銳平滑對(duì)稱，最佳的洗脫條件見(jiàn)表1。

2.3 前處理步驟優(yōu)化

2.3.1 提取液選擇 目前常用的提取劑有乙腈、甲醇、丙酮等[32-33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比純甲醇、80%甲醇水溶液、80%乙腈水溶液進(jìn)行提取。在同一加標(biāo)水平，三種提取液提取效果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示純甲醇的總體回收率較差，因甲醇對(duì)脂肪具有一定的溶解性，會(huì)降低提取效果；80%乙腈水溶液比80%甲醇水溶液總體回收率略高，因乙腈比甲醇使蛋白質(zhì)變性的能力更強(qiáng)，為降低基質(zhì)影響，最后選擇80%乙腈水溶液作為提取液。

表3 不同提取液回收率比較Table 3 Comparison of recovery rates of different extracts

2.3.2 酯化態(tài)DSP（DTX-3）水解釋放 據(jù)所查閱資料，對(duì)DSP 提取方法研究大多數(shù)都未涉及到DTX-3。DTX-3 是OA、DTX-1、DTX-2 的酯化態(tài)形式，存在于貝類樣品中[33-34]，本身對(duì)人體無(wú)害，但其在堿性條件下可以水解釋放出有毒的OA、DTX-1、DTX-2，致人中毒。因此實(shí)驗(yàn)前處理中加入水解一步，這樣更能準(zhǔn)確定量貝類中DSP 的含量。

2.3.3 凈化方法的選擇 貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)和脂肪等，待測(cè)樣品凈化不足極易污染離子源，導(dǎo)致HPLC-MS/MS 的檢測(cè)易被雜質(zhì)干擾，從而靈敏度下降，定量偏低，所以凈化方法對(duì)結(jié)果影響很大。為了降低基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膬艋椒ā１緦?shí)驗(yàn)比較了液液萃取、固相萃?。ò≒rime HLB 固相萃取小柱、MCX 固相萃取小柱、腹瀉性貝類毒素免疫親和柱）和QuECHERS 凈化方法對(duì)DSP 的加標(biāo)回收效果如下表4所示。

表4 不同凈化方法比較Table 4 Comparison of different purification methods

液液萃取技術(shù)試劑用量大，操作繁雜，并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，降低提取效率；Waters Prime HLB 固相萃取小柱，無(wú)需活化，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易操作，并且凈化脂肪、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)能力較強(qiáng)，通用能力較強(qiáng)，但是對(duì)毒素吸附性較強(qiáng)，不易洗脫干凈，導(dǎo)致大部分毒素回收率偏低至50%以下，對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度影響較大；Waters MCX 混合型陽(yáng)離子交換柱，由于具有磺酸基基團(tuán)，所以對(duì)堿性化合物具有很高的選擇性和靈敏度。交換柱對(duì)于GYM、SPX、OA、PTX2、AZA-1 凈化效果尚佳，回收率范圍為82.4%～107.3%，但對(duì)其他毒素凈化效果較差，回收率范圍為72.6%～79.7%，整體偏低；腹瀉性貝類毒素免疫親和柱回收率在90.2%～104.7%間，回收效果很好，但操作復(fù)雜，成本非常昂貴，不適合大批量檢測(cè)。

因C18可以有效去除脂類和碳水化合物，所以采用以C18粉和無(wú)水硫酸鎂的混合物對(duì)腹瀉性貝類毒素進(jìn)行凈化的QuEChERS 方法。但過(guò)量使用C18也會(huì)降低回收率。多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，如果預(yù)先加入0.1 g無(wú)水硫酸鎂，再加入0.05 g 凈化吸附劑C18，即可獲得最高的回收率。9 種毒素回收率均在87%～112%的范圍為內(nèi)，凈化效果較好。對(duì)于基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品，無(wú)需增加額外的處理，即可達(dá)到滿意的凈化效果，同時(shí)節(jié)省了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間和成本，因此實(shí)驗(yàn)前處理選擇QuECHERS 凈化方法。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限 為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果的影響，將100 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液用空白基質(zhì)配制成線性范圍為0.5～50 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各目標(biāo)化合物的濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值的峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將陰性樣品中添加9 種腹瀉性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，使得上機(jī)檢測(cè)理論濃度為0.5 ng/mL，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)回收試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)定信噪比（S/N）均大于3，按照檢出限公式：檢出限=3×對(duì)照品濃度×樣品稀釋體積/信噪比/取樣量，計(jì)算出目標(biāo)物檢出限。相應(yīng)的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 5 Linear equation of reference material, decision coefficient, detection limit

由表5可知，9 種腹瀉性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.996～0.999 之間，線性良好，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。歐盟對(duì)于親脂性海洋生物毒素AZA-1、 AZA-2、 AZA-3、 OA、 DTX-1、 DTX-2、PTX-2 的限制濃度為160 μg OA 當(dāng)量/kg，GYM 的限制濃度為200 μg OA 當(dāng)量/kg，SPX1 的限制濃度為100 μg OA 當(dāng)量/kg[33,35-37]，本方法的檢出限比歐盟管制毒素規(guī)定濃度的0.05 倍還低，仍可獲得大于3 的信噪比，說(shuō)明檢測(cè)靈敏度良好。

2.4.2 方法的平均回收率和精密度 分別在空白樣品中加入不同濃度的9 種腹瀉性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照優(yōu)化方法條件進(jìn)行處理和檢測(cè)，每個(gè)目標(biāo)物添加三個(gè)濃度梯度，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算低、中、高三個(gè)濃度梯度的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度（RSD）。

由表6 數(shù)據(jù)可知，9 種化合物三個(gè)濃度梯度的回收率在 87.2%～111.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，由此可以說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合實(shí)際分析檢測(cè)的要求。

表6 回收率和精密度Table 6 Recovery rate and precision

2.5 實(shí)際貝類樣品測(cè)定

用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測(cè)海南省五個(gè)城市市售的菲律賓蛤仔、魁蚶、華貴櫛孔扇貝等約十個(gè)品種的貝類，對(duì)檢出率和超標(biāo)率進(jìn)行分析（表7）。我國(guó)大部分沿海海域，如廣東沿海、江浙海域均有DSP 的污染存在，個(gè)別海域超標(biāo)率竟達(dá)77%[38-43]。此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，海南省近岸海域貝類腹瀉性貝類毒素的污染概率較大，但是超標(biāo)率不高。

表7 不同海域中DSP 的檢出率和超標(biāo)率Table 7 Detection rate and over - standard rate of DSP in different sea areas

3 結(jié)論

貝類毒素種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、樣本基質(zhì)較為復(fù)雜，為盡量避免或減少假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，研究開發(fā)高分辨率質(zhì)譜測(cè)定技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)，多種毒素同時(shí)定性定量的檢測(cè)技術(shù)是非常必要的。本方法可同時(shí)檢測(cè)9 種DSP，OA、DTX1、DTX2、PTX2、GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3在質(zhì)量濃度0.5～50 ng/mL 的范圍內(nèi)，其線性相關(guān)系數(shù)均在0.996 以上，檢出限為1～10 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐盟立法機(jī)構(gòu)所確定的限量要求，回收率為87.2%～111.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.2%。本方法的線性相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率、精密度均能滿足腹瀉性貝類毒素的日常檢測(cè)需要，并且一個(gè)樣品從前處理到上機(jī)檢測(cè)，最多只需要2 h 就可以完成。結(jié)果表明，在眾多方法中HPLC-MS/MS 可滿足多種毒素同時(shí)檢測(cè)需求，操作簡(jiǎn)便快捷、特異性高、靈敏度較高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中損失較小，穩(wěn)定性重現(xiàn)性均良好，而且節(jié)約成本，適合大批量檢驗(yàn)。