纖維素酶協(xié)同超聲波輔助提取北沙參多糖工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)活性研究

景永帥，袁鑫茹，代立霞，張瑞娟，張 浩，鄭玉光 ，吳蘭芳

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.石家莊市中醫(yī)院肛腸科，河北石家莊 050051；3.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊 050200）

北沙參（Glehniae Radix）是珊瑚菜（Glehnia littoralisFr. Schmidt ex Miq.）的根，為藥食兩用資源，其甘、微苦，微寒，歸肺、胃經(jīng)。具有養(yǎng)陰清肺，益胃生津等功效[1]。研究表明北沙參中含有多糖類、磷脂、香豆素類等多種有效成分[2]，其中含量最多的是多糖類，也是其主要有效成分之一，具有抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。

在多糖的研究過(guò)程中，多糖的提取是研究的第一步，也是研究過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，多糖的提取方法主要有熱水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法及聯(lián)合輔助提取法等，每法各有優(yōu)劣，如熱水提取法在多糖的提取中最為常用，其工藝簡(jiǎn)單、操作安全、成本較低，但得率不高，且耗時(shí)長(zhǎng)[5]。微波和超聲波提取法具有效率高、時(shí)間短、溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，但微波和超聲波可能會(huì)引起多糖的降解，改變多糖分子結(jié)構(gòu)[6]。酶法提取是一種高效、環(huán)保的方法，已被證明可提高多糖得率，同時(shí)還具有投資成本低、能耗低的優(yōu)點(diǎn)，但是可能會(huì)對(duì)多糖各組分之間的比例造成影響[7-8]。多種技術(shù)的聯(lián)合使用，可以充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)各法存在的缺點(diǎn)，提高多糖的得率，保證多糖質(zhì)量穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)選用纖維素酶協(xié)同超聲波輔助提取法提取GLP，綜合單因素考察結(jié)果，利用Box-Behnken 響應(yīng)面法確定多糖的最佳提取工藝；并進(jìn)一步探究其理化性質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)活性，以期為GLP 的后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北沙參（批號(hào)2019061501） 康美藥業(yè)股份有限公司；纖維素酶 酶活力1×105U·g-1，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；各單糖標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；無(wú)水乙醇 分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠。

101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 泰斯特儀器有限公司；TGL-15B 型高速離心機(jī) 安亭科學(xué)儀器廠；HH-2 型恒溫水浴鍋 金壇宏華儀器廠；KS-300DE型超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；EYELAN-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會(huì)社；UV-2550 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器有限公司；1220 型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；JSM-7610F 型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 日本電子。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北沙參粗多糖提取工藝流程 取北沙參藥材，粉碎，過(guò)40 目篩，3 倍體積的95%乙醇回流提取2次，除脂，過(guò)濾得到的藥渣烘干備用。

稱取4.6 g 除脂后的干燥藥渣，加入樣品重量2%的纖維素酶，加入30 倍體積的蒸餾水，60 ℃提取，提取完成后，將溫度調(diào)至95 ℃，并維持10 min 使纖維素酶滅活，冷卻，再置于數(shù)控超聲波中50 ℃，210 W 超聲提取20 min。重復(fù)上述步驟，合并2次提取液，離心（9000 r/min、5 min），收集上清液，過(guò)濾，減壓濃縮至原體積的1/4，加入4 倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，冰箱4 ℃靜置過(guò)夜，抽濾，收集沉淀，真空干燥后即得GLP。

1.2.2 熱水提取法制備北沙參粗多糖 稱取4.6 g 除脂后的干燥藥渣，加入30 倍體積的蒸餾水，于100 ℃水浴鍋中回流提取2 h，提取2次，合并2次提取液，其他步驟同1.2.1，得熱水提取GLP。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 稱取4.6 g 除脂后的干燥藥渣，蒸餾水作為溶劑，預(yù)設(shè)料液比1:30 g·mL-1、纖維素酶添加量2%、酶解溫度60 ℃、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度50 ℃、超聲波功率210 W 為工藝流程中的常規(guī)量，以酶解時(shí)間（0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、料液比（1:20、1:30、1:40、1:50 g·mL-1）、超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、超聲溫度（40、50、60、70、80 ℃）、纖維素酶添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）5 個(gè)單因素變量替換工藝流程中相應(yīng)的常規(guī)量，考察各因素對(duì)北沙參粗多糖得率的影響。

1.2.4 Box-Behnken 法優(yōu)化提取工藝 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步采用Box-Behnken 法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）、酶解時(shí)間（C）三個(gè)因素為變量，以GLP 的得率為響應(yīng)值，尋找最佳提取工藝，Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factor levels of experimental design

1.2.5 多糖得率的測(cè)定 按式（1）計(jì)算北沙參粗多糖的得率。

式中：E 為多糖得率，%；m1為粗多糖質(zhì)量，g；m2為北沙參粉末質(zhì)量，g。

1.2.6 北沙參多糖的理化性質(zhì)分析

1.2.6.1 微觀形態(tài)觀察 將GLP 溶液超聲分散后，滴于樣品臺(tái)上，經(jīng)噴金處理后，采用SEM 進(jìn)行分析，加速電壓3.0 kV，分辨率7.2 mm，分別放大不同的倍數(shù)進(jìn)行觀察[3]。

1.2.6.2 熱穩(wěn)定性分析 稱取GLP 2.0 mg，利用TGA-DSC 進(jìn)行熱重分析，由室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min[9]。

1.2.6.3 官能團(tuán)分析 利用FT-IR，在4000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[10]。

1.2.6.4 單糖組成測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，Eclipse XDBC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫30 ℃；上樣量20 μL；流速1 mL/min；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH6.85）-乙腈（83:17，v/v）；洗脫方式為等度洗脫。

1.2.7 免疫調(diào)節(jié)活性

1.2.7.1 RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，基于37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)（完全培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基:FBS:雙抗=100:10:1），24 h 后，更換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%，且細(xì)胞形態(tài)良好時(shí)，傳代培養(yǎng)。

1.2.7.2 細(xì)胞種板 調(diào)整細(xì)胞濃度2×105個(gè)/mL 后接種于96 孔板中，每孔100 μL 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7.3 GLP 對(duì)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的影響 通過(guò)MTT 法[12]進(jìn)行測(cè)定：待孵育24 h，細(xì)胞完全貼壁后，按GLP 濃度0、0.5、1、10、50、100、250 μg·mL-1給予GLP 孵育24 h，每組5 個(gè)復(fù)孔；孵育24 h 后，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 儲(chǔ)備液10 μL，繼續(xù)孵育4 h；孵育結(jié)束后，用注射器小心吸棄上清，再加入150 μL 二甲基亞砜，于震板儀上充分溶解甲臜結(jié)晶10 min 后，在波長(zhǎng)為490 nm 處測(cè)吸光度，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7.4 GLP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的影響 分別加入濃度為0、0.5、1、10、50、100、250 μg·mL-1的GLP 繼續(xù)孵育24 h，用終濃度為1 μg·mL-1的LPS 刺激后[13]，按上述方法檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，細(xì)胞試驗(yàn)均為5次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)分析由Design Expert 8.0 軟件完成，采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，用Origin 8 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)北沙參粗多糖得率的影響 由圖1可知，在0.5～1.0 h 范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖的得率顯著增加（P＜0.05），在1.0～1.5 h 范圍內(nèi)，多糖的得率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在1.5～2.0 h 范圍內(nèi)，多糖的得率又呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），再延長(zhǎng)酶解時(shí)間時(shí)，得率反而下降。由于在一定時(shí)間內(nèi)，隨著纖維素酶酶解時(shí)間的增加，可能導(dǎo)致部分含有β-1,4 葡萄糖糖苷鍵的多糖降解，從而使得率降低[14]。所以將最優(yōu)酶解時(shí)間定為2.0 h。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the yield

2.1.2 料液比對(duì)北沙參粗多糖得率的影響 從圖2可以看出，多糖得率隨著料液比先增加后降低，而當(dāng)料液比為1:30 g·mL-1時(shí)，多糖的得率達(dá)到最大，這是因?yàn)樵龃笕軇┝?，?huì)增大北沙參顆粒與溶劑接觸面積，使多糖充分溶解，而當(dāng)料液比由1:30 g·mL-1增加到1:40 g·mL-1時(shí)，多糖的得率顯著下降（P＜0.05），由于其他成分溶出的影響，以及溶液中的多糖被北沙參殘?jiān)?，多糖的得率有所降低[15]。所以將最優(yōu)料液比定為1:30 g·mL-1。

圖2 料液比對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)北沙參粗多糖得率的影響 由圖3可知，在20～40 min 內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖的得率顯著提高（P＜0.05），再繼續(xù)增加超聲時(shí)間，得率反而下降?？赡苡捎诔晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖發(fā)生降解，分子量變小，醇沉?xí)r得到的多糖沉淀變少，導(dǎo)致得率降低[16]。而在60 min 時(shí)多糖的得率增加，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)，少部分剩余北沙參殘?jiān)募?xì)胞壁破碎，使得細(xì)胞內(nèi)多糖類物質(zhì)溶解在溶劑中，因此得率有所升高。綜合分析，為了降低耗能，節(jié)約資源，方便操作，選取得率最高時(shí)的時(shí)間40 min 為最佳超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield

2.1.4 超聲溫度對(duì)北沙參粗多糖得率的影響 由圖4可以看出，在40～60 ℃時(shí)，多糖得率基本隨著溫度的升高呈上升趨勢(shì)，超過(guò)60 ℃時(shí)，得率顯著降低（P＜0.05），由于超聲波提取過(guò)程中溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致多糖在超聲波的作用下發(fā)生降解，糖苷鍵斷裂，分子量降低，得率會(huì)顯著降低[17]，所以將超聲溫度選定為60 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield

2.1.5 纖維素酶添加量對(duì)北沙參粗多糖得率的影響由圖5 可以看出，在1.0%～2.0%范圍內(nèi)，酶量越大，得率越高，而當(dāng)酶量為2%時(shí)，得率達(dá)到最大值。超過(guò)2.0%后，得率顯著下降（P＜0.05）。因?yàn)槔w維素酶能夠有效破壞植物細(xì)胞壁，利于多糖的釋放。而當(dāng)酶量繼續(xù)增加時(shí)，有限的底物濃度抑制酶解過(guò)程或者過(guò)量的酶包吸附在北沙參顆粒表面，阻止多糖進(jìn)一步溶出[18]，從而使多糖的得率下降。所以將最優(yōu)纖維素酶添加量定為2.0%。

圖5 酶量對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the yield

2.2 Box-Behnken 法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 由以上幾組單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，酶解時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)工藝的影響較大，而酶量和料液比則可固定為2%和1:30 g·mL-1。根據(jù)三因素三水平的原則，將超聲溫度定為55、60、65 ℃；超聲時(shí)間定為35、40、45 min；酶解時(shí)間定為1.5、2.0、2.5 h，設(shè)計(jì)17 組試驗(yàn)（表2）。

表2 多糖得率的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results of the yield of polysaccharide

采用Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，對(duì)回歸方程進(jìn)行分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)[18]。擬合回歸方程為：

對(duì)該方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知，此模型的P=0.0002，說(shuō)明本試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪蔷哂酗@著性的。失擬誤差P為3.68，不顯著，則說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)的擬合情況較好。擬合系數(shù)R2值為0.9699，可以認(rèn)為模型解釋了96.99%響應(yīng)值的變化。由此說(shuō)明，可以用此模型對(duì)纖維素酶協(xié)同超聲波輔助提取GLP 的工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[19]。顯著性結(jié)果表明，交互項(xiàng)AC、BC 及二次項(xiàng)B2、C2的P值均小于0.01，對(duì)響應(yīng)值影響極為顯著。根據(jù)表3 得出，對(duì)GLP 得率的影響大小為C＞A＞B。

2.2.2 等高線圖和響應(yīng)曲面分析 等高線圖中心橢圓越接近圓形，表明因素的交互作用越不明顯；曲面圖越陡峭，說(shuō)明交互作用越顯著[20]。由圖6可知，當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，多糖的得率先上升后下降。當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，隨著超聲溫度的升高，多糖的得率呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。由圖7可知，當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，多糖的得率隨著超聲溫度的升高而緩慢提高。當(dāng)超聲溫度一定時(shí)，在一定范圍內(nèi)，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的得率越高，超出這個(gè)范圍，多糖的得率則呈下降的趨勢(shì)。由圖8可知，當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，多糖的得率隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢(shì)。相反，當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，多糖的得率隨著酶解時(shí)間的增加呈緩慢上升趨勢(shì)。由以上可以看出，酶解時(shí)間和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)得率影響的響應(yīng)面圖等高線圖為橢圓形，曲面圖陡峭，結(jié)合表3 中的方差分析顯示，酶解時(shí)間和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)得率的影響較為顯著。

圖6 超聲溫度與超聲時(shí)間交互作用對(duì)得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on yield

圖7 超聲溫度與酶解時(shí)間交互作用對(duì)得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature and enzymolysis time on yield

圖8 超聲時(shí)間與酶解時(shí)間交互作用對(duì)得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time and enzymolysis time on yield

2.2.3 優(yōu)化模型后的驗(yàn)證 采用Design-Expert 8.0軟件，最優(yōu)工藝為：超聲溫度65 ℃，超聲時(shí)間40.80 min，酶解時(shí)間1.87 h，此時(shí)預(yù)測(cè)的GLP 得率為41.25%。為了說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果的真實(shí)性，需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]實(shí)際操作，將超聲時(shí)間定為41 min，酶解時(shí)間定為112 min。在纖維素酶添加量2%、料液比1:30 g·mL-1、超聲功率210 W、超聲溫度65 ℃、超聲時(shí)間41 min和酶解時(shí)間112 min 的條件下進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，最終得到的多糖得率為39.58%±0.90%。較預(yù)測(cè)值41.25%誤差為1.62%＜2%，說(shuō)明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)GLP 的提取工藝。課題組前期研究表明，超聲波提取的多糖得率為12.13%[21]，熱水回流提取的多糖得率為23.93%[22]，而纖維素酶協(xié)同超聲波輔助得率為39.58%±0.90%，多糖得率明顯提高。采用苯酚-硫酸法測(cè)定[6]可溶性總糖含量，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為b=9.1a+0.0824（R2=0.998），經(jīng)計(jì)算樣品中總糖含量為90.40%。因此，新的提取技術(shù)在多糖提取中具有良好的應(yīng)用前景。

2.3 理化性質(zhì)分析

2.3.1 北沙參多糖的微觀形態(tài) 由圖9 可以看出，GLP 表面孔洞較少，表面不平整。而之前的研究表明，采用傳統(tǒng)的熱水提取法得到的北沙參粗多糖，外觀光滑平整。相反，超聲波輔助提取得到的多糖表面粗糙，孔洞較多。纖維素酶提取的多糖呈塊狀[23]，這些結(jié)果與本研究不同?？赡苁怯捎诤屠w維素酶協(xié)同超聲波的作用，多糖的平面和鏈狀結(jié)構(gòu)被降解聚集成小分子碎片堆積起來(lái)，使其生物活性顯著增強(qiáng)[24]。

圖9 GLP 掃描電子顯微鏡圖Fig.9 Scanning electron microscope of GLP

2.3.2 熱穩(wěn)定性分析 由圖10 可以看出多糖的吸熱和放熱的情況。根據(jù)熱重分析曲線，可以了解GLP的熱裂解溫度和失重率[25]。從熱重曲線可知，GLP分為三個(gè)階段。第一階段為10～150 ℃，失重率為6.98%，這個(gè)階段是主要是自由水的流失；第二階段為150～500 ℃，失重率為63.18%，說(shuō)明GLP 受熱分解，化學(xué)鍵被破壞；第三階段為500～800 ℃，失重率為2.43%，失去的主要是總灰分中的有機(jī)物質(zhì)[26]。由此可見(jiàn)，GLP 的熱降解溫度約為300 ℃，總失重率約為73%，因此GLP 具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖10 GLP 差示掃描量熱曲線圖Fig.10 Thermogravimetric analysis-differential scanning calorimetry curves of GLP

2.3.3 紅外光譜分析 由圖11 可以看出，樣品具有多糖的特征吸收峰，在3400 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)寬峰是O-H 伸縮振動(dòng)引起的；2930 cm-1處的吸收峰是C-H 的伸縮振動(dòng)；1637 cm-1附近可能是O-H 引起的彎曲振動(dòng)吸收峰、C-O 吸收峰或COO-不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；1021 cm-1處特征吸收峰為醚鍵的彎曲振動(dòng)；849 cm-1為α-葡萄糖苷鍵的吸收峰[27]。

圖11 GLP 紅外光譜圖Fig.11 Fourier transform infrared spectroscopy of GLP

2.3.4 單糖組成 由圖12可知，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，GLP主要由葡萄糖組成。于欽輝等[4]通過(guò)DEAE-52 纖維素柱對(duì)北沙參粗多糖進(jìn)行分離純化，得到的D1 組分只含有葡萄糖，與本研究結(jié)果一致。

圖12 單糖標(biāo)準(zhǔn)品及GLP 高效液相色譜圖Fig.12 HPLC of monosaccharide standard and GLP

2.4 免疫活性調(diào)節(jié)

由圖13a可知，不同濃度多糖均能促進(jìn)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的增殖，顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），且濃度為10、50 μg·mL-1時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖效果最好。另外，可以看出北沙參多糖在試驗(yàn)范圍內(nèi)（0.5～250 μg/mL）對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。巨噬細(xì)胞在LPS 的誘導(dǎo)下，不僅細(xì)胞增殖能力和吞噬能力明顯增強(qiáng)，而且還能夠釋放大量的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，如一氧化氮、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等，這些介質(zhì)會(huì)對(duì)病原微生物的入侵產(chǎn)生抵御作用，但是過(guò)量分泌則會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，因此LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化模型被用做炎癥模型[28]。由圖13b 可以看出，經(jīng)LPS 處理后，巨噬細(xì)胞明顯活化，加入多糖樣品后，多糖能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的過(guò)度活化。與LPS 組相比，在0.5～250 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)均能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度活化（P＜0.01）。這可能是因?yàn)槎嗵桥c細(xì)胞表面受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制LPS 與細(xì)胞受體結(jié)合，防止LPS 過(guò)度誘導(dǎo)細(xì)胞活化[13]。與空白對(duì)照組相比，在低濃度范圍內(nèi)（0.5、1、10 μg·mL-1），使其恢復(fù)到正常水平，且無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而在高濃度范圍內(nèi)（50、100、250 μg·mL-1），使其低于正常水平，出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。因此，低濃度的GLP 能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞過(guò)度活化。Du 等[29]分離純化了一種新的多糖GRP（北沙參多糖），結(jié)果顯示GRP 對(duì)A549 細(xì)胞增殖和RAW 264.7 細(xì)胞NO 生成有抑制作用，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞和RAW 264.7 細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，GLP 具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。

圖13 多糖的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.13 Immunomodulatory activity of polysaccharides

3 結(jié)論

本研究采用纖維素酶協(xié)同超聲波輔助法提取GLP。采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝優(yōu)化條件，得出最佳提取工藝為：超聲功率210 W，酶解時(shí)間112 min，料液比1:30 g·mL-1，超聲溫度65 ℃，超聲時(shí)間41 min，纖維素酶添加量2%。在此條件下，GLP 的得率為39.58%±0.90%，理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，GLP 具有多糖的特征吸收峰和良好的熱穩(wěn)定性，主要由葡萄糖組成。以上結(jié)果表明，該法提取得到的多糖得率較高，且穩(wěn)定性好，為其他多糖的提取提供了一定的參考價(jià)值。

巨噬細(xì)胞積極參與宿主對(duì)外源性病原體和微生物的免疫防御，是免疫細(xì)胞分化成多種功能細(xì)胞并在免疫應(yīng)答中發(fā)揮相應(yīng)作用的前提與基礎(chǔ)。體外免疫活性研究結(jié)果表明，在0.5～250 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，GLP 均能顯著促進(jìn)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。其中，在10、50 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的增殖效果最好。而在低濃度時(shí)（0.5、1、10 μg·mL-1），GLP 能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化，說(shuō)明北沙參多糖可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景。