刺葡萄錦葵色素酶促酰化反應(yīng)條件的優(yōu)化

蔡愛(ài)麗，黃名勇，王 政，咼亞波，趙 倩, ，鄧潔紅,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省天香生物科技有限責(zé)任公司，湖南邵陽(yáng) 422000）

刺葡萄是葡萄科葡萄屬植物，木制藤本[1]。刺葡萄來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，但果粒小、種子多，不便鮮食，是優(yōu)秀的加工原材料[2]。紫黑色的刺葡萄果皮中含有大量的純天然錦葵色素，為花色苷單體，具有保健功效和巨大的應(yīng)用潛能[3-6]?；ㄉ兆鳛橐环N水溶性色素，在日常環(huán)境中穩(wěn)定性差，易分解變色[7]，容易受溫度[8-9]、光照[10-11]、pH[12-13]等外界因素的影響，不能用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。錦葵色素屬于類(lèi)黃酮化合物[14]，分子結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)活潑羥基[15]，使其穩(wěn)定性受到影響。羥基數(shù)量越多，錦葵色素的穩(wěn)定性越低。而?；幕ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)具有空間位阻效應(yīng)，能減少水解反應(yīng)和花色苷的分子內(nèi)凸起，防止花色苷轉(zhuǎn)化成假堿和查爾酮結(jié)構(gòu)，從而提高其穩(wěn)定性[16-18]。

研究者一般通過(guò)化學(xué)法實(shí)現(xiàn)花色苷?；痆19-20]，改善花色苷穩(wěn)定性和脂溶性。但由于花色苷結(jié)構(gòu)中的活性羥基均能?；?，化學(xué)法選擇性低，易與母核上的主要活性酚羥基結(jié)合或阻斷，導(dǎo)致削弱甚至喪失原有的抗氧化活性[21]。此外，采用化學(xué)法?；瘯r(shí)，產(chǎn)物難以分離純化；且反應(yīng)較為劇烈且有毒，會(huì)造成環(huán)境污染等[22-23]。近年，有學(xué)者針對(duì)花色苷酶促酰化開(kāi)展了研究[18,24]，發(fā)現(xiàn)酶促?；姆磻?yīng)條件比較溫和，?；稽c(diǎn)明確，酰化產(chǎn)物單一，純度較高，彌補(bǔ)了化學(xué)法?；磻?yīng)存在的缺陷[25]。同時(shí)，酶的高效性和選擇專(zhuān)一性，可大大提升底物酰化反應(yīng)的?；省Ｍㄟ^(guò)?；磻?yīng)，能提高花色苷的抗氧化性[26]、脂溶性[27]和穩(wěn)定性[28-29]。

目前，花色苷酶促?；奈墨I(xiàn)大多采用矢車(chē)菊3-O-葡萄糖苷作為研究對(duì)象，錦葵色素的酶促?；匆?jiàn)報(bào)道。研究表明，酰基供體和反應(yīng)條件的選擇不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率相當(dāng)?shù)蚚30]。因此，探尋刺葡萄錦葵色素?；磻?yīng)的最適條件，對(duì)提高刺葡萄的利用率及其工業(yè)價(jià)值是非常重要的。本研究以刺葡萄為試驗(yàn)原材料，刺葡萄中錦葵素-3,5-O-雙葡萄糖苷為反應(yīng)底物，以?；首鳛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，得到酶促?；姆磻?yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物摩爾比的最佳反應(yīng)條件區(qū)間；以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)建立的刺葡萄錦葵色素酶促酰化反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件，為錦葵色素的穩(wěn)定化及工業(yè)利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺葡萄 從中方縣刺葡萄果園基地購(gòu)回，用自來(lái)水沖洗干凈，晾干后剝皮，在-20 ℃冰箱中冷凍貯藏；錦葵啶-3,5-雙葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Phyto Lab公司；脂肪酶Candila Antarctica-B（CAL-B，Novozym 435） 諾維信生物技術(shù)有限公司；叔丁醇、月桂酸乙烯酯 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；分子篩4A 型（工業(yè)級(jí)）、甲醇、乙醇、鹽酸、乙醚、乙酸乙酯 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AEY-220 電子分析天平 湘儀儀器設(shè)備有限公司；HJ-4A 恒溫磁力攪拌器 上海比朗儀器有限公司；e2695 高效液相色譜儀 美國(guó)Waters 公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D 循環(huán)水式真空泵 予華儀器有限責(zé)任公司；THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器、HH-8 恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；真空冷凍干燥機(jī) 丹麥Heto 公司；TDZ5 離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺葡萄錦葵色素單體的制備 參照課題組前期試驗(yàn)成果[31]，制備刺葡萄錦葵色素-3,5-O-雙葡萄糖苷（Malvidin-3,5-O-diglucoside）。

提?。捍唐咸压ひ?:4（g/mL）的料液比加入75%酸化乙醇（含0.03%鹽酸），在避光環(huán)境下，浸提24 h 真空濃縮后離心，經(jīng)過(guò)2次無(wú)水乙酸乙酯和無(wú)水乙醚萃取，脫除有機(jī)溶劑，得到錦葵色素粗提液。

純化：HP-20 樹(shù)脂預(yù)處理后濕法裝柱，錦葵色素粗提液進(jìn)樣至流出液的吸光度值為上樣液的1/10。首先用蒸餾水沖洗, 再用體積分?jǐn)?shù)為80%、含0.05%鹽酸的酸化乙醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃濃縮，真空凍干，再用甲醇溶解。

單體制備：通過(guò)半制備型高效液相制備，色譜條件：柱子：XCharge C18柱（20 mm×250 mm，10 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；流動(dòng)相A：2%甲酸溶液；流動(dòng)性B：甲醇；進(jìn)樣量：1.2 mL；流速：15 mL/min；柱溫：30 ℃；洗脫程序：0 min：30% B，5 min：35% B，8 min：40%B，12 min：50% B，18 min：60% B，20 min：80% B。

參考文獻(xiàn)[31]進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，獲得3 種色素，經(jīng)過(guò)超高效液相色譜三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析鑒定選取錦葵素-3,5-O-雙葡萄糖苷為試驗(yàn)單體。

1.2.2 脂肪酶催化花色苷?；磻?yīng)

1.2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響 將活化后的4A 型分子篩放入叔丁醇中進(jìn)行干燥，在5 個(gè)帶塞小瓶中加入2 mL 脫水叔丁醇、0.01 mmol 錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷、0.10 g 分子篩和0.15 mmol 月桂酸乙烯酯混合均勻，連續(xù)攪拌至完全溶解，加入40 mg 脂肪酶CAL-B，pH 為3.0 時(shí)在恒溫振蕩器（45 ℃，200 r/min）中分別反應(yīng)24、30、36、42、48 h 后，5000 r/min 離心15 min 后取上清液，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，真空蒸餾后，溶解于10 mL 的甲醇中，攪拌至完全溶解后，12000 r/min離心10 min，取上清液。用體積分?jǐn)?shù)為0.01%的甲酸甲醇溶液稀釋50 倍，液相色譜手動(dòng)進(jìn)樣20 μL 進(jìn)行分析。?；磻?yīng)前后，試驗(yàn)均在避光條件下進(jìn)行。利用歸一法計(jì)算出峰面積，獲得反應(yīng)的?；?，探討反應(yīng)時(shí)間對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響。

1.2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響 按照1.2.2.1 的方法，將錦葵色素的酰化反應(yīng)溫度分別設(shè)置為40、45、50、55、60 ℃，反應(yīng)42 h后終止反應(yīng)。經(jīng)液相色譜分析后計(jì)算反應(yīng)的?；?，探討反應(yīng)溫度對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響。

1.2.2.3 底物摩爾比對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響 按照1.2.2.1 的方法，在錦葵色素?；磻?yīng)過(guò)程中分別添加0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol的月桂酸乙烯酯，使底物的摩爾比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，55 ℃下反應(yīng)42 h。經(jīng)液相色譜分析后計(jì)算反應(yīng)的?；?，探討底物摩爾比對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促酰化反應(yīng)的影響。

1.2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物摩爾比為試驗(yàn)因素，以?；蕿轫憫?yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken 原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平表如表1所示。每組試驗(yàn)重復(fù)三次，通過(guò)Design-Expert V8.0.6 軟件，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到試驗(yàn)最優(yōu)條件方案。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels of response surface optimization test

1.2.3 酶促?；磻?yīng)?；实挠?jì)算 ?；磻?yīng)后，利用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。分析條件如下：

流動(dòng)相A：1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：PDA 紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：520 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

低壓梯度洗脫條件：0 min：5% B，5 min：20% B，20 min：90% B，30 min：90% B，45 min：20% B。

花色苷的?；视?jì)算公式為：

式中：S1表示反應(yīng)后?；a(chǎn)物的峰面積；S0表示反應(yīng)后未?；ㄉ盏姆迕娣e。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果。使用Origin 2017 64 Bit 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖，用SPSS 21.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；磻?yīng)前后的高效液相色譜分析

利用高效液相對(duì)酶促?；磻?yīng)前后的刺葡萄錦葵色素進(jìn)行分析。從圖1A 可看出，未酰化花色苷單體在520 nm 檢測(cè)只有一個(gè)色譜峰，計(jì)算出制備的刺葡萄錦葵色素單體純度為98.76%。圖1B 為酰化反應(yīng)后花色苷的液相色譜圖，在520 nm 可以檢測(cè)到兩個(gè)色譜峰，與未?；纳V圖相比，多了一個(gè)?；a(chǎn)物峰。這說(shuō)明刺葡萄錦葵色素?；磻?yīng)可能生成了單?；a(chǎn)物，脂肪酶催化區(qū)域選擇性較高，只有一個(gè)?；稽c(diǎn)，能更好地分離純化出?；ㄉ諉误w。通過(guò)?；a(chǎn)物的峰面積確定酶促?；磻?yīng)的酰化率，證明酶促?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率。

圖1 酰化反應(yīng)前后樣品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatographic of the sample before and after the acylation reaction

2.2 反應(yīng)條件對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響

如圖2A所示，隨著?；磻?yīng)時(shí)間的增加，酰化率先提高后降低。?；磻?yīng)時(shí)間為24～42 h 時(shí)，錦葵色素中?；w的濃度較高，酰化產(chǎn)物濃度較低，促進(jìn)反應(yīng)向正方向進(jìn)行，?；蕪?9.8%提高到43.2%。但是，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到42 h 后，酰化反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)，且刺葡萄錦葵色素及?；a(chǎn)物長(zhǎng)時(shí)間處于高溫下發(fā)生分解，?；式档汀Ｒ虼?，選取反應(yīng)時(shí)間36、42、48 h 為最優(yōu)梯度。

酶促?；磻?yīng)容易受到溫度的影響。在一定溫度范圍內(nèi)，升高溫度能增加底物分子能量和活化的底物分子，相應(yīng)增加了單位時(shí)間內(nèi)底物分子有效碰撞次數(shù)，從而促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。如圖2B所示，反應(yīng)溫度低于55 ℃時(shí)，脂肪酶CAL-B 的活性、底物的溶解度以及反應(yīng)體系中底物有效碰撞次數(shù)都隨著反應(yīng)溫度的提高而增多，?；室搽S之提高。在55 ℃時(shí)，錦葵色素的?；首罡撸^續(xù)升高反應(yīng)溫度，?；书_(kāi)始降低。因?yàn)楫?dāng)溫度過(guò)高且在有機(jī)溶劑中時(shí)，肽鍵的水解和二硫鍵的破壞被加劇，脂肪酶的酶蛋白會(huì)發(fā)生變性最終失活[32-33]。同時(shí)，溫度過(guò)高導(dǎo)致了錦葵色素及其?；a(chǎn)物的降解[34]。因此，選取反應(yīng)溫度50、55、60 ℃為最優(yōu)梯度。

刺葡萄錦葵色素酶促酰化體系屬于雙底物可逆反應(yīng)，反應(yīng)中同時(shí)存在酶促水解副反應(yīng)[35]。在酰化反應(yīng)體系中，加入過(guò)量的?；w，能夠提高反應(yīng)體系中底物與脂肪酶之間的碰撞，從而提高反應(yīng)的?；?。同時(shí)提高雙底物中一種底物的濃度，有利于熱力學(xué)平衡向?；磻?yīng)的方向進(jìn)行。因此，最佳摩爾比的確定，既能保證反應(yīng)充分發(fā)生，同時(shí)也能節(jié)省試劑。底物摩爾比對(duì)酰化率的影響結(jié)果如圖2C所示，當(dāng)刺葡萄錦葵色素與月桂酸乙烯酯的摩爾比從1:10～1:25時(shí)，刺葡萄錦葵色素的?；手饾u升高，繼續(xù)提高月桂酸乙烯酯的濃度，脂肪酶的活性受到影響，反應(yīng)的酰化率開(kāi)始降低。綜合考慮，選取底物摩爾比1:20、1:25 和1:30 為最優(yōu)梯度。

圖2 反應(yīng)條件對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)的影響Fig.2 Effects of reaction conditions on the enzymatic acylation of malvidin

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)反應(yīng)時(shí)間（A）、反應(yīng)溫度（B）、底物摩爾比（C）三個(gè)因素進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選取每個(gè)因素的最優(yōu)梯度，以酰化率為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)17 個(gè)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface optimization test

2.4 回歸方程方差分析

通過(guò)Design-Expert V8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)?；蔣（%）的二次多元回歸方程：

Y=49.96+0.3125A-0.9500B-0.4625C-1.65AB-1.48AC-0.2500BC-3.14A2-3.37B2-2.24C2。

以刺葡萄錦葵色素的?；蕿轫憫?yīng)值，對(duì)三個(gè)因素（反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物摩爾比）的回歸方差分析結(jié)果如表3所示。該回歸方程模型回歸極顯著（P＜0.0001），且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度好。函數(shù)的決定系數(shù)R2=0.9818，說(shuō)明該模型可以解釋大部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此可以用該模型預(yù)測(cè)和分析不同反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度和底物摩爾比對(duì)刺葡萄錦葵色素酶促?；磻?yīng)體系?；实挠绊憽?/p>

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Regression equation analysis results

由P值可以看出，反應(yīng)時(shí)間（A）和反應(yīng)溫度（B）的影響極顯著（P＜0.01），底物摩爾比（C）影響不顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著（P＜0.01）。AB、AC的P值均小于0.01，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間與底物摩爾比交互作用對(duì)酰化率的影響極顯著。

2.5 響應(yīng)面因素交互作用分析

響應(yīng)面等高線圖及響應(yīng)圖，反映了試驗(yàn)因素之間的交互作用，響應(yīng)曲面越陡峭，因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著；而響應(yīng)面投射出的等高線形狀，如果呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著，如果接近圓形則表示兩因素交互作用不顯著。

由圖3A可知，在底物摩爾比不變的情況下，反應(yīng)時(shí)間在36～48 h，反應(yīng)溫度在50～60 ℃范圍內(nèi)，刺葡萄錦葵色素的酰化率先升高后降低，且等高線圖呈橢圓形，三維曲面圖較陡峭，說(shuō)明兩者之間的相互影響顯著，得到的結(jié)果與回歸方程分析中AB 的P值一致。由圖3B可知，在反應(yīng)溫度不變的情況下，反應(yīng)時(shí)間在36～48 h，底物摩爾比在1:20～1:30 范圍內(nèi)，刺葡萄錦葵色素的?；氏壬吆蠼档停业雀呔€圖呈橢圓形，三維曲面圖較陡峭，說(shuō)明兩者之間的相互影響顯著，得到的結(jié)果與回歸方程分析中AC的P值一致。而圖3C 中，等高線圖呈圓形且三維曲面圖較平緩，說(shuō)明反應(yīng)溫度與底物摩爾比之間的相互影響不顯著。

圖3 各因素交互作用的等高線圖及響應(yīng)圖Fig.3 Contour diagram and response diagram of interaction of various factors

2.6 響應(yīng)面最佳反應(yīng)參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design Expert 優(yōu)化后的刺葡萄錦葵色素酶促酰化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)時(shí)間42.75 h、反應(yīng)溫度54.16 ℃、底物摩爾比1:24.32，此條件下?；暑A(yù)測(cè)為50.09%，結(jié)合試驗(yàn)可行性，將反應(yīng)條件調(diào)整為反應(yīng)時(shí)間43 h，反應(yīng)溫度54 ℃，底物摩爾比1:24。該條件下進(jìn)行三次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)試驗(yàn)，得?；蕿?9.92%±0.12%，與預(yù)測(cè)?；实南鄬?duì)誤差為0.12%。

3 結(jié)論

本文首先以刺葡萄錦葵色素的?；蕿橹笜?biāo)，分別探討反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物摩爾比對(duì)酶促?；磻?yīng)的影響。其次通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)行回歸方程方差分析，結(jié)果顯示回歸方程模型回歸極顯著（P＜0.0001）。最終，根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得到最佳反應(yīng)條件，結(jié)合試驗(yàn)可行性，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為43 h，反應(yīng)溫度為54 ℃，底物摩爾比為1:24 時(shí)，刺葡萄錦葵色素的酶促?；磻?yīng)的?；蕿?9.92%±0.12%，與模型預(yù)測(cè)值50.09%的相對(duì)誤差為0.12%，說(shuō)明該反應(yīng)條件合理可靠。本研究為天然花青素酰化研究提供了新的數(shù)據(jù)，為其在食品和保健品中的應(yīng)用提供了依據(jù)。但是，酶促?；磻?yīng)位點(diǎn)對(duì)花色苷穩(wěn)定性及抗氧化活性的影響還需要更加深入的探索。