基于可培和免培法探究大曲生產(chǎn)環(huán)境空氣微生物群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空性特征

劉英杰，黃 鈞，唐慧芳，張宿義，董 異，王 超，王小軍，吳重德，金 垚，周榮清,2,

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646699；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646699）

中國(guó)傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)過程中，大曲既是粗酶制劑和發(fā)酵劑[1]，也是重要的釀酒原料之一。釀酒所需的功能微生物多數(shù)是源于大曲，而大曲中的微生物主要富集于生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)施，環(huán)境群落結(jié)構(gòu)和多樣性及過程參數(shù)顯著影響大曲的群落結(jié)構(gòu)及代謝物[2-4]。

環(huán)境微生物是導(dǎo)致大曲功能菌群的時(shí)空性差異的關(guān)鍵因素。近十年間，環(huán)境的群落與大曲群落及代謝物的相關(guān)性被廣泛關(guān)注?？膳嗯c免培方法揭示了濃、醬香型大曲的核心菌群構(gòu)成各有特點(diǎn)[5-6]，并分離到一些功能菌株。夏、秋兩季醬香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)和演變規(guī)律存在較大差異[7]，且與環(huán)境的溫濕度密切相關(guān)[8]，類似的結(jié)果也曾被相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]。真菌群落的結(jié)構(gòu)與小生境密切相關(guān)[4]，大曲生產(chǎn)環(huán)境的空氣及大曲細(xì)菌群落的變化同樣具有相關(guān)性[11]，清香型白酒發(fā)酵過程中耐酸乳桿菌（Lactobacillus. acetotolerans）主要源于空氣和發(fā)酵罐[12]，應(yīng)用溯源技術(shù)也探究了小生境與白酒生產(chǎn)過程主要環(huán)節(jié)群落的關(guān)系[4,13-14]。然而，這些結(jié)果都難以解釋大曲生產(chǎn)環(huán)境中微生物群落的時(shí)空性特征。鑒于現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)的局限性，如可培方法僅能檢出0.1%～1%的環(huán)境存在的微生物[15-16]，而基于PCR 的高通量測(cè)序顯著提高檢出微生物種類的范圍[17]，但量化的結(jié)果有待完善，兩種方法同時(shí)用于探討小生境群落與大曲群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、二者間相互作用和變遷規(guī)律以及穩(wěn)定性評(píng)估[18]等則是解決當(dāng)前技術(shù)瓶頸的有效措施。

為揭示大曲生產(chǎn)環(huán)境空氣微生物群落的時(shí)空性特征，本文以相同地域不同地點(diǎn)且使用周期差異明顯的濃香型大曲生產(chǎn)地為對(duì)象，采用可培和免培技術(shù)研究了冬、春和夏三個(gè)季節(jié)環(huán)境空氣中微生物群落的演變規(guī)律，解析了環(huán)境因子與環(huán)境空氣群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，為探討大曲與環(huán)境微生物的相互關(guān)系及溯源性研究奠定方法學(xué)基礎(chǔ)，并為生產(chǎn)區(qū)域營(yíng)造大曲生產(chǎn)的最佳環(huán)境微生物群落組成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空氣樣品 采集于石堡灣的瀘州老窖制曲生態(tài)園（簡(jiǎn)稱老廠，LC，四川省，瀘州市，龍馬潭區(qū)，28°55'22''N、105°28'36''E）和黃艤的瀘州老窖制曲中心（簡(jiǎn)稱新廠，XC，四川省，瀘州市，江陽區(qū)，28°51'46''N、105°34'14''E），前者始于上世紀(jì)90 年代，已使用25年，后者自2019 年建成僅使用2 年，兩廠生產(chǎn)的大曲為同類型大曲，即濃香型大曲。采樣地點(diǎn)和具體位置如圖1 和表1所示，采樣時(shí)間分別是2021 年1 月（冬）、3～5 月（春）和7 月（夏）等三個(gè)季節(jié)，缺少秋季數(shù)據(jù)是老廠因地方政府建設(shè)規(guī)劃的要求，在夏季須整體拆除，同時(shí)春季環(huán)境溫度、濕度波動(dòng)較大，將春季細(xì)分為初春（3 月）、仲春（4 月）、暮春（5 月）三季；Fast DNA SPIN 基因提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；Q5 DNA 高保真聚合酶 美國(guó)New England Biolabs 公司；瓊脂糖和瓊脂糖凝膠電泳緩沖液TAE、PicoGreen dsDNA 檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Invitrogen 公司；Marker DL2000 日本Takara 公司；Agencourt AMPure Beads 美國(guó)Beckman Coulter 公司；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PCA 瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；納他霉素 上海麥克林生化科技有限公司。

表1 采樣位置及環(huán)境因子Table 1 Sampling locations and environmental factors

圖1 老廠（A）和新廠（B）的采樣位置Fig.1 Sampling locations of old plant (A) and new plant (B)

PSW-6 型篩孔撞擊式采樣器、PSW-Y 型液體撞擊式采樣器 常州普森電子儀器廠；AR866 風(fēng)速儀泰安市瑞科航岳機(jī)械有限公司；CX31 顯微鏡 日本Olympus 公司；GL-20G-Ⅱ立式高速冷凍離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器有限公司；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計(jì) 美國(guó)ThermoFisher 公司；2720 PCR 擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI 公司；Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免培養(yǎng)方法 空氣樣品通過液體撞擊式采樣器收集于15 mL 無菌的0.1 mol/L PBS 緩沖液中，采樣期間正值大曲生產(chǎn)，天氣晴朗或多云，平均風(fēng)速＜2 m/s，采樣流量控制為12.0 L/min，采樣時(shí)間為15 min，然后裝入50 mL 無菌離心管，4 ℃保存待處理，采集完后及時(shí)在超凈工作臺(tái)中使用溶劑過濾器通過0.22 μm 硝酸纖維素濾膜進(jìn)行抽濾，并將濾膜放回50 mL 離心管中，保存至-80 ℃冰箱待DNA 的提取、擴(kuò)增。

1.2.2 可培養(yǎng)方法 參考GB 4789.2-2016 和GB 4789.15-2016，采用篩孔撞擊式采樣器將環(huán)境中的細(xì)菌和真菌分別撞擊在添加0.1%納他霉素的PCA 瓊脂培養(yǎng)基（抑制霉菌和酵母）和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基得以收集，采樣流量28.3 L/min，采樣時(shí)間各10 min，采樣高度固定在1.2 m。樣品采集后及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，分別于37 和28 ℃培養(yǎng)細(xì)菌和真菌48 h，并對(duì)各級(jí)平板計(jì)數(shù)。

1.2.3 環(huán)境因子的測(cè)定 采樣過程中，AR866 型風(fēng)速儀和TES1360A 型溫濕度計(jì)測(cè)量采樣點(diǎn)的風(fēng)速、溫度和濕度，記錄風(fēng)向，并從中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站查詢記錄大氣污染物（PM2.5、PM10、NO2、SO2、O3、CO）和空氣質(zhì)量指數(shù)（air quality index，AQI）[19]，具體見表1。

1.2.4 微生物的計(jì)數(shù)與分離 按照以下公式計(jì)算各采樣點(diǎn)的菌落數(shù)。

式中：P 為空氣細(xì)菌或真菌數(shù)（CFU/m3）；N 為六級(jí)平板的細(xì)菌或真菌數(shù)；T 為采樣時(shí)間（min）；Q 為采樣流量（28.3 L/min）。根據(jù)菌落形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果，分別對(duì)細(xì)菌和真菌進(jìn)行分類并編號(hào)，采用平板劃線法和稀釋涂布平板法對(duì)所選微生物進(jìn)行分離純化，挑選出單菌落，斜面培養(yǎng)后4 ℃冰箱保存，待分子生物學(xué)鑒定。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定 使用TSINGKE 植物DNA提取試劑盒（通用型）提取純化的分離株的總DNA，分別使用16S 通用引物（27F/1492R）和ITS 通用引物（ITS1/ITS4）分別進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定其分類水平。

1.2.6 DNA 的提取、擴(kuò)增及高通量測(cè)序 按照He等[20]和Tang 等[21]所述方法進(jìn)行總DNA 提取和PCR擴(kuò)增。按照Fast DNA SPIN 提取試劑盒供應(yīng)商提供的操作程序提取空氣樣品的總DNA 后，Nanodrop ND-1000 測(cè)定其濃度和評(píng)估純度，再用0.8%瓊脂糖凝膠電泳估算其分子量大小。分別使用通用引物338F/806R 和通用引物ITS5F/ITS1R 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4 區(qū)和真菌rRNA 基因的ITS1 區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agencourt AMPure Beads 純化，使用PicoGreen dsDNA 檢測(cè)試劑盒定量。PCR 純化產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq 基因測(cè)序試劑盒v3 進(jìn)行2×300 bp 雙端測(cè)序。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 采用QIIME pipeline 處理原始序列，依據(jù)Caporaso 等[22]所述方法去除低質(zhì)量序列，包括長(zhǎng)度＜150 bp，序列平均質(zhì)量＜20，單堿基重復(fù)數(shù)＞8 bp 以及模糊的堿基。最后利用UCLUST 算法將高質(zhì)量的序列以97%的序列相似度聚成不同的操作單元（operational taxonomic unit，OTU）[23]。隨后在Greengenes（Release 13.8，http://greengenes.secondgenome.com/）和UNITE（Release 8.0，https://unite.ut.ee/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索比對(duì)這些序列，最后生成OTU 表，記錄每個(gè)樣本中各OTU 的豐度和分類。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26.0 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有試驗(yàn)平行3次，數(shù)據(jù)以平均值±相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME（v1.8.0）進(jìn)行，使用R 軟件（v4.0.5）進(jìn)行組間相關(guān)性分析、主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA），并采用貝葉斯算法軟件SourceTracker（v1.0）[24]分別對(duì)新老廠內(nèi)外環(huán)境空氣微生物進(jìn)行溯源分析，其他統(tǒng)計(jì)分析使用Origin 2021。

2 結(jié)果與分析

2.1 同域不同點(diǎn)空氣中可培微生物群落結(jié)構(gòu)及與環(huán)境因子的相關(guān)性探討

同季節(jié)，同域不同點(diǎn)可培細(xì)菌存在顯著差異，可培真菌除夏季外差異顯著（P＜0.05），可培真菌數(shù)高于細(xì)菌數(shù)，初春和仲春老廠真菌數(shù)顯著高于新廠（P＜0.05），夏季老廠細(xì)菌數(shù)顯著高于新廠（P＜0.05）。冬季時(shí)，老廠總菌數(shù)多高于新廠類似位置的，而在暮春和夏季，新廠持續(xù)生產(chǎn)，老廠因待變遷，偶爾生產(chǎn)，制曲車間菌群數(shù)小于前者（圖2）。春季，新廠各采樣點(diǎn)的菌群數(shù)是漸增，老廠則存在波動(dòng)，可能與老廠間歇生產(chǎn)有關(guān)（圖3）。仲春和暮春的溫度和濕度適合微生物生長(zhǎng)繁殖，兩個(gè)環(huán)境中菌落數(shù)在仲春和暮春時(shí)達(dá)到峰值或轉(zhuǎn)折點(diǎn)（圖3）?？傮w上，冬、春、夏三季的菌群數(shù)是增加后降低的，季節(jié)間差異顯著，且真菌群數(shù)較細(xì)菌群變化顯著。

圖2 同季節(jié)不同位置的微生物計(jì)數(shù)結(jié)果Fig.2 Microbial counting results at different locations in the same season

圖3 相同位置不同季節(jié)微生物計(jì)數(shù)平均結(jié)果Fig.3 Average results of microbial counts in different seasons at the same location

菌落總數(shù)、細(xì)菌和真菌數(shù)與環(huán)境因子的Spearman 相關(guān)性結(jié)果（表2）顯示，菌落數(shù)與環(huán)境溫度正相關(guān)，但與濕度、風(fēng)速、風(fēng)向呈負(fù)相關(guān)。細(xì)菌數(shù)與空氣污染指數(shù)多呈正相關(guān)，尤其是與O3濃度正相關(guān)性顯著。真菌菌落數(shù)與環(huán)境溫度正相關(guān)性顯著，與除O3外的空氣污染指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性。溫度顯著影響可培微生物的生長(zhǎng)，空氣污染程度可能是導(dǎo)致群落不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。曾報(bào)道風(fēng)速導(dǎo)致真菌孢子濃度差異顯著[25]，大氣中的O3抑制微生物生長(zhǎng)[19]，與當(dāng)前的結(jié)果略有差異，可能與檢出的種屬有關(guān)，其原因待進(jìn)一步探討。

表2 可培微生物計(jì)數(shù)與環(huán)境因子的Spearman 相關(guān)系數(shù)Table 2 Spearman correlation coefficient between cultivable microbial count and environmental factors

2.2 可培微生物群落的差異性

基于形態(tài)特征獲得的分離株，細(xì)菌的16S 系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4A 和圖4B所示。其中，細(xì)菌包括101個(gè)種，51 屬，且老廠和新廠分別包含27 個(gè)屬57 個(gè)種和24 個(gè)屬44 個(gè)種。類似曾報(bào)道的結(jié)果[26]，除專性或嚴(yán)格厭氧的擬桿菌門Bacteroidetes 難培養(yǎng)外，已鑒定的37 個(gè)屬主要是Actinobacteria（15）、Proteobacteria（11）、Firmicutes（10）、Deinococcus-Thermus（1），前三者豐度分別為40.54%、29.73%和27.0%。優(yōu)勢(shì)菌都是Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Kocuria、Streptomyces等，老廠的數(shù)量高于新廠的，Agrococcus等13 個(gè)屬僅在前者中是次優(yōu)菌，Stenotrophomonas等10 個(gè)屬則在后者是次優(yōu)屬。此外，空氣中可培優(yōu)勢(shì)細(xì)菌可能對(duì)大曲優(yōu)勢(shì)細(xì)菌有貢獻(xiàn)，如Bacillus subtilis和Bacillus velezensis[20]等。

可培真菌包括50 個(gè)屬69 個(gè)種，老廠和新廠分別是29 個(gè)屬37 個(gè)種和21 個(gè)屬32 個(gè)種。真菌的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4C 和圖4D所示，真菌Ascomycota（18）、Basidiomycota（9）和Mucoromycota（3）的比例分別是60%、30%和10%，優(yōu)勢(shì)真菌屬包括Aspergillus、Penicillium、Gladaxporism等，老廠霉菌和酵母數(shù)高于新廠的，Aspergillussp.、Rhizopussp.、Lichtheimia ramosa等和Saccharomycopsis fibuligera亦同樣是大曲中檢出的優(yōu)勢(shì)霉菌和酵母[6,7]。

圖4 可培微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹及新老廠分類Venn 圖Fig.4 Phylogenetic tree of culturable microorganisms and Venn diagram of new and old plant classification

2.3 免培微生物α-多樣性及與環(huán)境因子的相關(guān)性探討

各樣品16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)和ITS 區(qū)分別共檢出22289 和44964 個(gè)OTU，兩個(gè)生產(chǎn)地點(diǎn)的α-多樣性差異如圖5所示。同季節(jié)，兩廠細(xì)菌的α-多樣性僅略有差異，季節(jié)間差異顯著。細(xì)菌豐富度和多樣性從冬、春、夏季間是增后又減，在仲春季時(shí)最高，與冬和夏兩季的差異顯著（P＜0.05）。真菌的多樣性也類似細(xì)菌的，暮春時(shí)，α-多樣性達(dá)到最大，顯著高于初春的（P＜0.05）。此外，真菌的α-多樣性顯著小于細(xì)菌的，且不同于可培的結(jié)果，可能是部分菌不可培[27]。

圖5 不同季節(jié)環(huán)境空氣的α-多樣性Fig.5 α-Diversity of ambient air in different seasons

α-多樣性與環(huán)境因子的組間Spearman 相關(guān)性分析（表3）結(jié)果顯示，與可培結(jié)果類似，但真菌的豐富度與溫度和濕度分別是顯著正相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)，這兩個(gè)參數(shù)與細(xì)菌α-多樣性分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。可能由于細(xì)菌最適溫濕度、營(yíng)養(yǎng)需求（自養(yǎng)和異養(yǎng)）及好氧/厭氧的差異具有不同的生態(tài)位[28]，所以群落會(huì)因擾動(dòng)和環(huán)境變化改變其結(jié)構(gòu)、生理功能和相互作用關(guān)系，真菌群落多樣性則相對(duì)穩(wěn)定[29]。類似曾報(bào)道的結(jié)果[30]，空氣污染指數(shù)與真菌多樣性呈弱相關(guān)性，但與其豐富度呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)。

表3 α-多樣性與環(huán)境因子的Spearman 相關(guān)系數(shù)Table 3 Spearman correlation coefficient between α-diversity and environmental factors

2.4 免培微生物群落的差異性

免培和可培菌群的組成在門水平上無顯著性差異，屬水平群落組成結(jié)構(gòu)如圖6所示，季節(jié)對(duì)同域不同小生境的群落影響顯著，尤其是細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度。細(xì)菌菌群包括Proteobacteria、Acfinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes，其豐度分別在71.08%～99.54%、0.11%～24.22%、0.19%～5.73%、0.01%～1.07%，另外，Deinococcus-Thermus（0.04%～6.38%）也是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌之一。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括Pseudomonas、Acinetobacter、Rhodococcus、Staphylococcus及Bacillus等，其中Pseudomonas和Acinetobacter的豐度在冬、春、夏間分別是減后又增和增后又減。真菌菌群主要包括Ascomycota、Basidiomycota 和Mucoromycota，群落結(jié)構(gòu)較類似且穩(wěn)定，Ascomycota 中的Phialemoniopsis豐度較高。不同的細(xì)菌屬，除Agrobacterium兩種培養(yǎng)方法的結(jié)果是一致的，而Saccharomycopsis、Neurospora和Botrytis等3 個(gè)真菌屬僅被可培方法確認(rèn)。Pseudomonas、Staphylococcus、Bacillus、Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Pantoea等細(xì)菌屬和Aspergillus、Thermoascus、Pichia、Paecilomyces、Thermomyces、Rhizomucor、Rhizopus、Trichosporon等真菌屬也是大曲的優(yōu)勢(shì)屬[20]，而Rhodococcus、Massilia、Stenotrophomonas、Cupriavidus等可能是濃香型大曲生產(chǎn)環(huán)境中獨(dú)有的[31]。

圖6 細(xì)菌（A）和真菌（B）的屬水平群落組成Fig.6 Community composition at genus level of bacteria (A) and fungi (B)

2.5 免培微生物的β-多樣性及與環(huán)境因子的相關(guān)性探討

基于Bray-Curtis 距離的細(xì)菌和真菌的PCoA分析結(jié)果如圖7所示。冬夏兩季，老廠的細(xì)菌菌群組成差異顯著，春季的與冬、夏兩季的有很高的重疊率，新廠三季差異更顯著，變異系數(shù)更大。兩個(gè)生產(chǎn)環(huán)境的真菌群落結(jié)構(gòu)非常類似，僅老廠的冬、春季節(jié)的少數(shù)樣品的菌群組成略有差異，而新廠個(gè)別樣品距離較遠(yuǎn)。由此可見，長(zhǎng)期制曲小生境的菌群趨于穩(wěn)定且豐富度更高。

圖7 基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析Fig.7 Principal coordinate analysis based on Bray-Curtis distance

小生境群落中優(yōu)勢(shì)屬與環(huán)境因子的RDA 分析及網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系如圖8所示。環(huán)境因子與細(xì)菌屬（至少在一個(gè)組內(nèi)平均豐度大于5%，圖8A）和真菌屬（至少在一個(gè)組內(nèi)平均豐度大于0.5%，圖8B）的相關(guān)性分別是極顯著和顯著。Pseudomona與溫度呈正相關(guān)而與濕度、大氣污染指數(shù)等多呈負(fù)相關(guān)，Rhodococcus則是相反。Acinetobacter與Pseudomonas是負(fù)相關(guān)，具有明顯競(jìng)爭(zhēng)性（圖8A 和圖8C）。真菌受溫度等影響較小，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。除Phialemoniopsis外，真菌與空氣污染指數(shù)多呈負(fù)相關(guān)（圖8B），Aspergillus與Phialemoniopsis是負(fù)相關(guān)性，而與多數(shù)的真菌正相關(guān)，真菌群節(jié)點(diǎn)聯(lián)系（圖8D）顯著少于細(xì)菌的（圖8C）?？傊?xì)菌菌群結(jié)構(gòu)更豐富，易受季節(jié)的影響，真菌的群落相對(duì)穩(wěn)定。

圖8 細(xì)菌（A，C）和真菌（B，D）的優(yōu)勢(shì)屬與環(huán)境因子的相關(guān)性分析及優(yōu)勢(shì)屬相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.8 Correlation analysis between dominant genera of bacteria (A, C) and fungi (B, D) and environmental factors and correlation network analysis of dominant genera

基于貝葉斯算法軟件SourceTracker（v1.0）的季節(jié)間不同位點(diǎn)，即樓內(nèi)（sink）與樓外（source）的群落結(jié)構(gòu)的溯源分析結(jié)果如圖9所示，可見樓外空氣群落對(duì)樓內(nèi)環(huán)境的影響和貢獻(xiàn)在不同季節(jié)存在差異，這為解釋不同季節(jié)制曲環(huán)境不同和大曲微生物溯源提供了新的思路，但不同小生境內(nèi)微生物存在的交換和驅(qū)動(dòng)效應(yīng)[32]對(duì)大曲群落結(jié)構(gòu)的影響仍需待進(jìn)一步探討。

圖9 樓內(nèi)外空氣真菌（A，C）和細(xì)菌（B，D）的溯源和弦圖Fig.9 Tracing chord chart of air fungi (A, C) and bacteria (B,D) inside and outside building

3 結(jié)論

應(yīng)用可培和免培方法探討瀘州老窖同域不同制曲小生境的空氣微生物隨季節(jié)的變化趨勢(shì)的結(jié)果表明，可培微生物中細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)，冬、春、夏三季的菌群數(shù)和α-多樣性是先增后降的，且季節(jié)間差異顯著，尤其對(duì)真菌群數(shù)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，細(xì)菌的豐富度和多樣性則是顯著大于真菌的。環(huán)境空氣中細(xì)菌和真菌分別由Acfinobacteria、Proteobacteria、Firmicutes、 Bacteroidetes 以 及 Deinococcus-Thermus 與Ascomycota、Basidiomycota 及Mucoromycota 等構(gòu)成。同時(shí)，季節(jié)對(duì)同域不同小生境的群落影響顯著，不同屬的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異顯著?？諝庵械腜seudomonas、Staphylococcus、Bacillus等8 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和Saccharomycopsis、Lichtheimia等10 個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬可能是大曲中優(yōu)勢(shì)菌的來源。此外，環(huán)境溫度和濕度也顯著影響小生境群落結(jié)構(gòu)，空氣污染程度可能是導(dǎo)致群落波動(dòng)的原因，長(zhǎng)期的生產(chǎn)使用則使環(huán)境的物種數(shù)及多樣性趨于豐富和穩(wěn)定。研究結(jié)果表明制曲小生境的群落時(shí)空性特征顯著，且為探討大曲與環(huán)境微生物的相互關(guān)系及溯源性研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。