自由基接枝改性對(duì)乳清分離蛋白乳化穩(wěn)定性的影響

林佳宜，鄭佳純，李 雁，解新安，李 璐

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）由β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白以及免疫球蛋白組成[1]，具備優(yōu)良的乳化性，常作為大分子穩(wěn)定劑，用于構(gòu)建納米乳液體系。WPI 作為乳化劑雖綠色安全，但熱穩(wěn)定性差，在酸性條件下容易出現(xiàn)絮凝和沉淀[2]。因此常用物理或化學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行改性，以增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性[3]。

研究表明，蛋白質(zhì)與多酚之間可通過(guò)酶誘導(dǎo)、堿法和自由基接枝法來(lái)實(shí)現(xiàn)修飾改性，生成兼具抗氧化性及乳化性的交聯(lián)產(chǎn)物[4]。自由基接枝是通過(guò)蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的活性基團(tuán)和羥基自由基發(fā)生反應(yīng)，使多酚與蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵，共價(jià)鍵生成涉及不可逆的相互作用，從而形成更穩(wěn)定的結(jié)合物[5]。較于酶法和堿法，自由基接枝法在反應(yīng)過(guò)程中不涉及有機(jī)溶劑，且具有較高的安全性，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。目前對(duì)于蛋白質(zhì)-多酚的接枝改性研究主要集中在改性對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的改變及提高上，如Lu 等[6]通過(guò)自由基接枝法制備卵清蛋白（OVA）-綠原酸（CHA）接枝物并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)與未改性O(shè)VA 相比，OVA-CHA 接枝物的抗氧化活性大幅提高。Yi 等[7]則通過(guò)自由基法制備β-乳球蛋白（BLG）-兒茶素接枝產(chǎn)物并用于制備β-胡蘿卜素納米乳液，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下儲(chǔ)藏30 d 后BLG-兒茶素接枝物能顯著提高包封在納米乳液中β-胡蘿卜素的保留率，對(duì)多酚接枝對(duì)蛋白界面流變性及乳化穩(wěn)定性的影響等研究較少。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）是多酚中黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的主要活性成分，也是綠茶中含量最高的兒茶素，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種功效[8-9]。基于此，本文以EGCG作為多酚代表，通過(guò)自由基接枝法制備WPI-EGCG復(fù)合物，探究接枝EGCG 對(duì)WPI 界面流變性能及其所構(gòu)建納米乳液穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白（HPLC≥90%） 上海江萊生物技術(shù)有限公司；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（HPLC≥98%）、番茄紅素（HPLC≥90%） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；中鏈甘油三酯（MCT） 廣州耶尚貿(mào)易公司；過(guò)氧化氫（30%） 廣東省光華科技有限公司；抗壞血酸 廣州化學(xué)試劑廠；Folin-酚試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；疊氮化鈉 合肥天健化工有限公司；二甲基亞砜 天津市富宇試劑廠。

ATS AH-BASIC 高壓均質(zhì)機(jī) 江蘇ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司；FJ200 高速分散均質(zhì) 攪拌器上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；EVO MA 15 掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司；MCR502 模塊化智能型高級(jí)流變儀 奧地利Anton Paar。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 WPI-EGCG 接枝產(chǎn)物的制備 根據(jù)Gu 等[10]所述的方法稍作修改制備接枝物，用蒸餾水配制1%（w/v）的WPI 溶液，加入摩爾比為5:1.4 的過(guò)氧化氫和抗壞血酸作為引發(fā)劑，25 ℃水浴恒溫振蕩2 h 后加入EGCG 反應(yīng)24 h，將得到的溶液進(jìn)行透析，冷凍干燥，備用[11]。

1.2.2 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察 將待測(cè)樣品粉末固定在導(dǎo)電雙面膠帶上，在真空條件下將樣品濺射鍍上10 mm 厚的金層，在20 kV 的加速電壓和450 倍的放大倍數(shù)下觀察粉末的表觀形態(tài)。

1.2.3 空白乳液制備 以中鏈甘油三酸酯（MCT）為分散相，將WPI-EGCG 接枝物和WPI 溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH7.0）中，配制濃度分別為0.3%、0.5%、0.7%、1%、1.5%（w/v）的連續(xù)相，在25 ℃下100 r/min 磁力攪拌4 h。分散相與連續(xù)相按9:1的比例混合，在高速分散機(jī)的作用下以10000 r/min分散5 min 制得粗乳液，再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在110 MPa下循環(huán)均質(zhì)3次以形成O/W 納米乳液。

第三個(gè)驅(qū)動(dòng)是裝備制造業(yè)和新經(jīng)濟(jì)發(fā)展。今年以來(lái)，傳統(tǒng)行業(yè)用電低速增長(zhǎng)的同時(shí)，新興產(chǎn)業(yè)用電增速遙遙領(lǐng)先。前三季度，汽車(chē)制造業(yè)、金屬制品業(yè)、計(jì)算機(jī)通信設(shè)備制造業(yè)、通用設(shè)備制造業(yè)用電增速均超10%。服務(wù)業(yè)中的數(shù)據(jù)中心等用電量大幅增長(zhǎng)。

1.2.4 界面吸附蛋白含量的測(cè)定 將空白乳液在11000 r/min 下離心1 h，用一次性注射器吸出下清液后經(jīng)孔徑0.22 μm 的針筒過(guò)濾器（水系）過(guò)濾，再次在11000 r/min 下離心至水層中無(wú)乳脂析出。采用Folin-酚試劑盒測(cè)定水層中蛋白含量，取5 mL Folin-酚試劑加入到1 mL 水相中在室溫下反應(yīng)10 min，再加入0.5 mL Folin-酚試劑乙反應(yīng)30 min，500 nm 處測(cè)量吸光度值[12]。

式中：C0指乳液中總蛋白的濃度，mg/mL；C1指未吸附到界面上的蛋白濃度，mg/mL。

1.2.5 乳液流變學(xué)特性的測(cè)定 采用流變儀測(cè)定乳液的流變學(xué)特性，用不銹鋼平板探頭分別進(jìn)行剪切模式掃描和頻率掃描。常溫下將剛制備的空白納米乳液傾倒在測(cè)量平臺(tái)平鋪，設(shè)置間隙為1 mm，除去多余乳液。頻率掃描的參數(shù)設(shè)置為：應(yīng)變0.1%，頻率掃描范圍1～100 Hz。剪切模式掃描的參數(shù)設(shè)置為：0.1～100 s-1[13]。采用Ostwald/de waele 流動(dòng)曲線模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

式中：η為表觀黏度；γ為剪切速率（s-1）；K 為黏度系數(shù)（Pa·sn）；n 為流動(dòng)指數(shù)。

1.2.6 番茄紅素納米乳液的制備 分別以WPI-EGCG接枝物和WPI 作乳化劑，以中鏈甘油三酸酯（MCT）為分散相，構(gòu)建負(fù)載番茄紅素的納米乳液體系。具體做法如下：將WPI 和WPI-EGCG 分別溶解于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH7.0）中，配制0.7%的WPI和WPI-EGCG 蛋白溶液，加入0.02%（w/w）疊氮化鈉抑制微生物生長(zhǎng)。蛋白溶液在25 ℃下100 r/min磁力攪拌4 h，形成水相。MCT 油中分散0.3%（w/w）的結(jié)晶番茄紅素標(biāo)品，以此為油相。在高速分散機(jī)的作用下將油相加入水相中，以10000 r/min 分散5 min制得粗乳液，再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)在110 MPa 下循環(huán)均質(zhì)3次，以形成O/W 納米乳液[14]。

1.2.7 納米乳液粒徑及電位的測(cè)定 利用納米粒度及ζ-電位分析儀測(cè)定納米乳液的粒徑及電位。將乳液樣品稀釋100 倍后吸取適量于石英比色皿（電位測(cè)定用其專(zhuān)用比色皿）中，測(cè)試的參數(shù)為：水的折射率為1.33，測(cè)試溫度為25 ℃，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次，取平均值。

1.2.8 番茄紅素保留率的測(cè)定 取800 μL 的二甲基亞砜與200 μL 的番茄紅素納米乳液混合，加入2 mL的混合有機(jī)相（正己烷:二氯甲烷=3:1，v:v）進(jìn)行萃取，重復(fù)3次后上清液裝入離心管中在4000 r/min下離心15 min，取上層清液在472 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定番茄紅素的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出番茄紅素含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.052C-0.008，相關(guān)系數(shù)r=0.9969。以正己烷為空白對(duì)照。

式中，C2為在儲(chǔ)藏時(shí)間t 時(shí)乳液中番茄紅素的濃度，μg/mL；C3為儲(chǔ)藏前乳液中番茄紅素的濃度，μg/mL。

1.2.9 番茄紅素乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察 將番茄紅素乳液稀釋10 倍，取15 μL 的稀釋液滴到顯微鏡載玻片的中間位置并蓋上蓋玻片，靜置10 s 后使用光學(xué)顯微鏡在10 倍的放大倍數(shù)下觀察番茄紅素乳液的微觀狀態(tài)，并用數(shù)字圖像分析軟件MS Shot 軟件拍照保存圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本論文所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次或以上，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算整理和統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2019 軟件作圖，選擇Duncan 多重范圍檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，圖中同種物質(zhì)的不同字母表示具有顯著性差異，不同物質(zhì)之間用大小寫(xiě)進(jìn)行區(qū)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEM 分析

圖1為WPI 和WPI-EGCG 在放大倍數(shù)為450倍下的SEM 觀察結(jié)果?？梢钥闯?，WPI 和EGCG的共價(jià)相互作用導(dǎo)致其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。EGCG分子中含有較多的羥基，在接枝反應(yīng)中易與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[15]。WPI 具有典型的球蛋白光滑球狀結(jié)構(gòu)，接枝后的WPI-EGCG 復(fù)合物球狀結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)出致密的片狀結(jié)構(gòu),表明WPI 和多酚之間的共價(jià)相互作用破壞了蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的側(cè)鏈解開(kāi)并重新排列成片狀結(jié)構(gòu)[16]。這與Zhao 等[17]從大豆分離蛋白-EGCG 共價(jià)復(fù)合物的研究結(jié)果相一致。

圖1 WPI 和WPI-EGCG 接枝物的SEM 圖Fig.1 SEM images of WPI and WPI-EGCG grafts

2.2 界面蛋白吸附量

具有兩親性質(zhì)的蛋白質(zhì)作為乳化劑在界面上會(huì)自發(fā)從體相內(nèi)向界面吸附[18]，通過(guò)降低界面張力來(lái)形成吸附膜，從而達(dá)到穩(wěn)定乳液體系的目的。因此，蛋白乳化劑在界面上的吸附動(dòng)力學(xué)、展開(kāi)和重排、界面蛋白吸附量等界面行為與乳液穩(wěn)定性有密切聯(lián)系[19]。一般來(lái)說(shuō)，界面蛋白吸附量越高，蛋白吸附至水油界面的能力越強(qiáng)，乳液就越穩(wěn)定[20]。不同濃度下WPI和WPI-EGCG 在MCT 油-水界面上的界面蛋白吸附量結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 WPI 和WPI-EGCG 接枝物在油-水界面的蛋白吸附量Fig.2 Interface protein adsorption capacity of WPI and WPIEGCG grafts

由圖2 可得，隨著蛋白濃度的增大，WPI 作乳化劑的界面蛋白吸附量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，且在濃度為0.7%時(shí)，界面蛋白吸附量達(dá)到最大（8.04 mg/mL）；而接枝后的WPI-EGCG 復(fù)合物穩(wěn)定的乳液的界面蛋白吸附量隨著蛋白濃度的增大而不斷增大，且始終大于WPI（P＜0.05）；WPI-EGCG 接枝物在蛋白濃度為1.5%時(shí)，界面蛋白吸附量可達(dá)12.7 mg/mL。界面蛋白吸附能力與蛋白結(jié)構(gòu)的分子構(gòu)象柔順性和表面疏水性相關(guān)，據(jù)此推測(cè)WPI-EGCG 界面吸附量增大的原因可能是EGCG 的自由基接枝改性使WPI 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[21]。WPI 在自由基介導(dǎo)作用下，更多展開(kāi)的疏水性殘基和具有表面活性的多肽移動(dòng)到油水界面層上并吸附到小油滴上，導(dǎo)致界面吸附量增大[22-23]。在油水界面吸附過(guò)程中，WPIEGCG 展示出比WPI 更好的界面吸附能力，可能是因?yàn)樽杂苫又Ψ磻?yīng)引起WPI 的柔性發(fā)生變化，促使WPI-EGCG 能更加均勻地分散在乳液中，并且穩(wěn)定存在[24]。

2.3 流變學(xué)特性

界面流變特性是與以蛋白質(zhì)為乳化劑乳液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性相關(guān)的重要物理參數(shù)。界面剪切流變學(xué)可以通過(guò)測(cè)量黏度的變化來(lái)監(jiān)測(cè)聚合物在油/水界面處的吸附動(dòng)力學(xué)[25]。乳液黏度是評(píng)價(jià)乳液穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，其值越大，代表乳液的小液滴發(fā)生沉淀或者上浮的速度越慢，乳液的物理穩(wěn)定性越高[26]。

對(duì)不同濃度WPI 和WPI-EGCG 構(gòu)建的空白乳液進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切掃描，分析在1～100 s-1范圍內(nèi)剪切速率對(duì)表觀黏度的影響，結(jié)果如圖3所示。可以看出，不同濃度下的WPI 和WPI-EGCG 空白乳液的表觀黏度均隨剪切速率的增大而先急劇下降，而后趨于平緩，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)剪切速率在0.1～20 s-1范圍內(nèi)變化時(shí)，二者均表現(xiàn)出了假塑性流體的剪切稀釋特性，后面隨著剪切速率進(jìn)一步的增加，二者的黏度不再變化，并且與剪切方向平行，表現(xiàn)出牛頓型流體特征。WPI 和WPI-EGCG 乳液的黏度隨著蛋白濃度的增大而增大，不同濃度下WPI-EGCG 空白乳液的黏度值均高于WPI，原因可能是以蛋白質(zhì)自由基接枝物為乳化劑制備的乳液液滴之間的相互作用增強(qiáng)，液滴之間的吸引力驅(qū)動(dòng)聚合物的形成，從而在內(nèi)部空間形成顆粒的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致黏度增加[27]。但是在高剪切力作用下，WPI 和WPI-EGCG 乳液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨著剪切速率的增大而逐漸被破壞，聚合物變形破裂成小液滴，并在剪切力場(chǎng)下重新分布，使其流動(dòng)阻力變小，因而二者均表現(xiàn)出剪切稀釋特性[28]。

圖3 不同濃度WPI 和WPI-EGCG 制備的空白乳液的表觀黏度隨剪切速率的變化Fig.3 Changes of apparent viscosity of blank emulsions prepared by different concentrations of WPI and WPI-EGCG varies with shear rates

采用Ostwald/de Waele 流動(dòng)曲線模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見(jiàn)表1。靜態(tài)流變擬合參數(shù)測(cè)定結(jié)果中決定系數(shù)R2＞0.99，表明此模型能較為準(zhǔn)確地反映WPI 和WPI-EGCG 乳液的表觀黏度與剪切速率之間的關(guān)系。當(dāng)n＜1 時(shí)，乳液會(huì)表現(xiàn)出剪切減薄行為，且n 值越低，乳液剪切減薄行為越明顯，由表1可知，WPI 和WPI-EGCG 乳液均呈現(xiàn)假塑性流體特征（n＜1），說(shuō)明在高速剪切力下，由弱吸引力形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破環(huán)，這與圖3 表觀黏度隨剪切速率的增大而減小實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互驗(yàn)證。不同濃度的WPI 和WPI-EGCG 的空白乳液流變學(xué)測(cè)試表明自由基接枝后的WPI-EGCG 乳液具有更高的黏度，物理穩(wěn)定性也更強(qiáng)。

表1 不同濃度WPI 和WPI-EGCG 制備的空白乳液的靜態(tài)流變擬合參數(shù)Table 1 Static rheological fitting parameters of blank emulsions prepared with different concentrations of WPI and WPI-EGCG

2.4 以WPI 和WPI-EGCG 為乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液穩(wěn)定性研究

在儲(chǔ)藏的周期范圍內(nèi)，如果乳液液滴的大小分布、表面電荷，聚集狀態(tài)或在容器內(nèi)的空間分布方面沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明乳液的物理穩(wěn)定性越高。乳液的化學(xué)穩(wěn)定性是指在一定的儲(chǔ)藏時(shí)間內(nèi)負(fù)載的功能活性物質(zhì)含量的變化情況，保留率越高，代表化學(xué)穩(wěn)定性越好。因此，以WPI-EGCG 為乳化劑，WPI 為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定負(fù)載番茄紅素的納米乳液在37 ℃下儲(chǔ)藏30 d 內(nèi)粒徑、ζ-電位和番茄紅素的保留率，來(lái)評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)EGCG 自由基接枝改性后的WPI 乳化性能的變化。

2.4.1 粒徑及電位變化 納米粒度儀測(cè)出的由0.7%WPI 和0.7% WPI-EGCG 接枝物制備的番茄紅素納米乳液的初始平均粒徑分別為356 和406 nm，即接枝后的復(fù)合物在初始狀態(tài)下粒徑較大，這是共價(jià)接枝作用使得復(fù)合物的分子量增大的緣故。高壓剪切力的作用使得乳液被分散為小液滴并趨于穩(wěn)態(tài)，但由于復(fù)合物作為乳化劑向油水界面處吸附時(shí)液滴產(chǎn)生碰撞形成了大液滴，致使其粒徑的增大[29]。Gu 等[11]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)，未接枝的蛋清蛋白的粒徑比經(jīng)過(guò)兒茶素接枝的粒徑更小。

從圖4 可以看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，兩種乳液體系的粒徑均呈現(xiàn)不同程度的增加趨勢(shì)，到了第30 d 時(shí)的平均粒徑分別增加至799.1 和674.3 nm，由WPI 穩(wěn)定的乳液粒徑增長(zhǎng)速度比WPI-EGCG 接枝物制備的乳液增長(zhǎng)速度快，WPI-EGCG 接枝物還是表現(xiàn)出比WPI 更好的物理穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)楣矁r(jià)修飾改善了WPI 的兩親性，使得接枝產(chǎn)物降低界面張力的效果更好。另外，由前面界面蛋白吸附量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，WPI-EGCG 接枝物在油水界面上具有更好的界面吸附能力，同樣也會(huì)增強(qiáng)乳液體系的穩(wěn)定性。

圖4 37 ℃下0.7%的WPI 和WPI-EGCG 構(gòu)建的番茄紅素納米乳液的粒徑和電位變化情況Fig.4 Changes of particle size and potential of 0.7% WPI and WPI-EGCG nano-emulsions at 37 ℃

ζ-電位是蛋白表面電荷量的表征，可作為乳液體系穩(wěn)定性的衡量指標(biāo)[30]。一般來(lái)說(shuō)，電荷絕對(duì)值越大，說(shuō)明乳液體系越穩(wěn)定，因其所帶電荷多，彼此間斥力大，使得油脂分子不易聚集[31]。由圖4 電位測(cè)定結(jié)果可看出，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，乳液的ζ-電位也隨之下降。其中，由WPI 制備的番茄紅素納米乳液在30 d 儲(chǔ)藏期內(nèi)，其電位絕對(duì)值降低了23.4 mV，在第30 d 時(shí)的電位值達(dá)到了-22.3 mV，而WPI-EGCG制備的番茄紅素納米乳液在30 d 儲(chǔ)藏期內(nèi)，其電位絕對(duì)值僅降低了17.6 mV，在第30 d 時(shí)的電位值為-34.4 mV，說(shuō)明以WPI 為乳化劑構(gòu)建的乳液體系不穩(wěn)定，這可能是因?yàn)閮H由純蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液液滴的電荷相對(duì)較低而導(dǎo)致絮凝，負(fù)電荷降低的同時(shí)也伴隨著靜電或空間排斥力的降低，疏水相互作用或范德華力開(kāi)始占主導(dǎo)地位[32]。隨著WPI-EGCG 濃度的增大，由其制備的乳液ζ-電位之間的變化量較小，且電位值始終高于WPI 的番茄紅素納米乳液，說(shuō)明EGCG的自由基接枝改性改善了WPI 的物理穩(wěn)定性。

2.4.2 番茄紅素保留率 由圖5 發(fā)現(xiàn)，兩種乳化劑穩(wěn)定的番茄紅素納米乳液的保留率均隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，在儲(chǔ)藏30 d 時(shí)，WPI 穩(wěn)定的番茄紅素納米乳液番茄紅素保留率為35.49%，而WPI-EGCG接枝物穩(wěn)定的番茄紅素納米乳液保留率可達(dá)到66.23%，表現(xiàn)出更好的番茄紅素保護(hù)效果。這可能是因?yàn)镋GCG 具有強(qiáng)表面活性，會(huì)阻止番茄紅素和單線態(tài)氧或其它自由基之間發(fā)生氧化還原反應(yīng)[33]。同時(shí)，EGCG 改善了WPI 的乳化活性，使其更加迅速的吸附至油水界面，對(duì)番茄紅素提供了有效的保護(hù)[34]。Jiang 等[35]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)在14 d 的儲(chǔ)存期內(nèi)，用α-乳白蛋白-兒茶素接枝物穩(wěn)定的β-胡蘿卜素的保留量明顯大于α-乳白蛋白，這歸因于用兒茶素接枝改性后增強(qiáng)了α-乳白蛋白清除自由基和結(jié)合游離金屬離子的能力。

圖5 37 ℃下0.7%的WPI 和WPI-EGCG 構(gòu)建的番茄紅素納米乳液中番茄紅素保留率的變化情況Fig.5 Lycopene retention rate of 0.7% WPI and WPI-EGCG nanoemulsions at 37 ℃

2.5 番茄紅素納米乳液微觀形態(tài)

通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)不同貯藏時(shí)間下的WPI 與WPI-EGCG 為乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)在第0 d 時(shí)，二者的乳液體系未出現(xiàn)液滴聚集現(xiàn)象，乳液液滴顆粒清晰可見(jiàn)；第15 d 時(shí)，WPI 穩(wěn)定的乳液已開(kāi)始出現(xiàn)少量聚集的現(xiàn)象，且液滴顆粒附著在聚集物上，這可歸因于乳液液滴的重力作用及布朗運(yùn)動(dòng)，在高溫下加速了液滴之間的碰撞頻率形成一個(gè)大的聚集體，從而導(dǎo)致粒徑的增大[36]；第30 d 時(shí)，WPI 乳液液滴變化最為明顯，出現(xiàn)了大規(guī)模的聚集結(jié)構(gòu)。相反，由WPI-EGCG 穩(wěn)定的番茄紅素納米乳液在儲(chǔ)藏30 d 后僅看到有少量的聚集現(xiàn)象，說(shuō)明經(jīng)由自由基接枝改性作用后制備的乳液的乳化穩(wěn)定性更好，這可能是因?yàn)槠浔砻尕?fù)電荷較高，因此增強(qiáng)了液滴之間的靜電排斥力并改善了WPI的抗絮凝和聚結(jié)的性能[37]。

圖6 WPI 和WPI-EGCG 構(gòu)建的番茄紅素納米乳液不同貯藏時(shí)間的光學(xué)顯微鏡圖Fig.6 Optical microscopy of lycopene nano-emulsion constructed by WPI and WPI-EGCG after standing for different days

3 結(jié)論

本文通過(guò)制備WPI-EGCG 復(fù)合物研究自由基接枝改性對(duì)WPI 乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自由基接枝后的WPI 球狀結(jié)構(gòu)消失并轉(zhuǎn)變?yōu)槠瑺罱Y(jié)構(gòu)，在油水界面吸附過(guò)程中，WPI 在蛋白濃度為0.7%時(shí)界面蛋白吸附量達(dá)到最大值8.04 mg/mL，而WPIEGCG 接枝物在蛋白濃度為1.5%時(shí)界面蛋白吸附量可達(dá)12.7 mg/mL，WPI-EGCG 展示出比WPI 更好的界面蛋白吸附能力。流變學(xué)行為結(jié)果則顯示，經(jīng)EGCG 接枝改性后的WPI 乳液黏度更大。在37 ℃下儲(chǔ)藏30 d 后，與未改性WPI（番茄紅素保留率的35.49%）相比，以同濃度WPI-EGCG 為乳化劑構(gòu)建的番茄紅素納米乳液（保留率為66.23%）具有更好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，且在相同儲(chǔ)藏溫度下粒徑和ζ-電位的增長(zhǎng)幅度最小，同時(shí)微觀結(jié)構(gòu)中也沒(méi)有觀察到明顯的聚集現(xiàn)象，表現(xiàn)出相對(duì)較好的抗絮凝和聚結(jié)性能及乳化穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，WPI-EGCG 自由基改性可以提高蛋白的界面及流變特性，進(jìn)而有效提高載運(yùn)體系的穩(wěn)定性及負(fù)載物的保護(hù)效果。本研究可為具有長(zhǎng)期物理穩(wěn)定性及高保留率的功能活性物質(zhì)納米乳液載運(yùn)體系的構(gòu)建提供參考。