HPLC-MS/MS法研究阿立哌唑不同晶型的藥動學(xué)差異

郭歡迎,楊亞婷,王蓀璇,王嫦鶴

陜西省食品藥品檢驗研究院,西安 710065

藥物多晶型是指某一固體狀態(tài)藥物至少存在2種或2種以上的分子排列方式,這些不同的排列方式形成了多種不同狀態(tài)的晶型[1]。藥物常見的多晶型包括晶型態(tài)、無定型態(tài)、溶劑化物和水合物等。同一種藥物的不同晶型往往具有不同的理化性質(zhì),如熔點、化學(xué)反應(yīng)性、溶解度、密度、蒸氣壓和固體劑型的可制造性等[2-3]。對于水溶性差的藥物,其溶出往往成為體內(nèi)吸收過程的限速過程,從而影響療效和安全性[4]。阿立哌唑難溶于水,其晶型和粒度成為影響藥物吸收的主要因素,因此,針對阿立哌唑晶型的研究成為研究的熱點。

阿立哌唑(aripiprazole)化學(xué)名為7-[4-[4-(2,3-二氯苯基)-1-哌嗪基]丁氧基]-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮,為二氫喹啉酮類抗精神病藥[5]?？刹糠旨佣喟桶肥荏w(D2)及5-羥色胺受體(5-HT1A),使多巴胺信號穩(wěn)定在正常限度,同時拮抗5-HT2A受體,從而具有治療精神分裂癥的作用[5-6],阿立哌唑?qū)穹至寻Y的陽性和陰性癥狀均有治療作用[7]。阿立哌唑具有獨特的治療精神病的作用機(jī)制,相對于經(jīng)典的抗精神病藥物,如氯丙嗪、奮乃靜、氟哌啶醇、氯氮平等,其不但有效避免了錐體外系反應(yīng)的發(fā)生,而且降低了嗜睡及體質(zhì)量增加等一系列不良反應(yīng)的發(fā)生率[8]。

在體內(nèi),阿立哌唑主要經(jīng)3 種生物轉(zhuǎn)化途徑代謝,即脫氫化、羥基化和N-脫烷基化。細(xì)胞色素P450代謝酶CYP3A4 和CYP2D6 主要參與脫氧和羥基化,其中CYP3A4還參與N-催化脫烷基化。阿立哌唑的脫氫代謝產(chǎn)物脫氫阿立哌唑與D2受體具有相似的親和力,與阿立哌唑在臨床藥理效果上并無明顯差異。因此,阿立哌唑和脫氫阿立哌唑共同構(gòu)成本品抗精神病的有效成分[9]。

阿立哌唑是一種典型的多態(tài)性藥物,迄今已知存在17種多晶型[10-16]。本研究的前期工作已經(jīng)制備了阿立哌唑的4種晶型,并采用粉末X 線衍射法、差示掃描量熱法、紅外光譜法對4種晶型進(jìn)行了表征,通過與相關(guān)參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對[10-16],確定4種晶型分別為晶型α、晶型Ⅳ、倍半水合物和新晶型[17]。本研究通過對不同晶型藥代動力學(xué)的差異進(jìn)行研究,為阿立哌唑原料及劑型的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LCMS-8040型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(包括LC-30AD 泵、CTO-30A 柱溫箱、SIL-30AC自動進(jìn)樣器、SPD-20A 紫外檢測器、8040 三重四級桿質(zhì)譜儀、ATN-1050氮氣發(fā)生器、Lab Solution 色譜工作站,日本島津公司);ME235S型分析天平(德國賽多利斯公司);Vortex 4 型旋渦混勻器(德國IKA 公司);SCQ-200型超聲波清洗器(上海聲浦超聲設(shè)備廠);氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇常州國華電器有限公司)。

1.2 試藥

阿立哌唑的4種晶型,晶型α(Formα)、晶型Ⅳ(Form Ⅳ)、倍半水合物(sesquihydrate)和新晶型(new form)均為自制;阿立哌唑?qū)φ掌?批號100776-201302,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%),替米沙坦對照品(批號100629-201202)均購自中國食品藥品檢定研究院;脫氫阿立哌唑?qū)φ掌?批號38-GHZ-113-1,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);甲酸銨(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇和乙腈均為色譜純,均購自美國Honeywell Burdick &Jackson公司;高純水(美國Millipore公司);其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD 雄性大鼠,體質(zhì)量為(280±20) g,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心,許可證號為SCKX(陜)0073276。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Thermo-C18(100 mm×4.6 mm,1.7 μm);流動相:甲醇-50 mmol·L-1甲酸銨溶液(10∶90);流速:0.2 mL·min-1;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 用電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),正離子電離;毛細(xì)管電壓為1.82 kV;脫溶劑氣溫度為250 ℃,加熱模塊溫度為400 ℃,CID氣壓為230 kPa,噴霧器氮氣(N2)的流速為3.0 L·min-1,干燥氣體氮氣的流速為15.0 L·min-1;用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)的質(zhì)譜掃描方式測定(m/z):阿立哌唑448.0→285.1,脫氫阿立哌唑446.1→285.1,替米沙坦515.1→497.3。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取阿立哌唑、脫氫阿立哌唑?qū)φ掌犯?0 mg,分別置于100 mL量瓶中,用甲醇定容并稀釋至刻度。分別精密量取上述2種溶液適量,用甲醇定量稀釋,制成阿立哌唑和脫氫阿立哌唑質(zhì)量濃度分別為1、0.1 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取替米沙坦對照品10 mg,置于50 mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密量取上述溶液1 mL,置于100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得到質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 樣品的預(yù)處理

取血漿樣品100 μL,置于1.5 mL離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1)10 μL,渦旋振蕩1 min,加入醋酸乙酯500 μL,渦旋振蕩3 min,在4 ℃以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,在37 ℃下用氮氣吹干,加入100 μL 甲醇復(fù)溶,取5 μL 進(jìn) 樣分析。

2.4 專屬性

取大鼠空白血漿100 μL,分別加入混合對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL,按照2.3項下血漿樣品處理方法處理后,按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示,主成分與內(nèi)標(biāo)物的分離良好,內(nèi)源性物質(zhì)無干擾,該方法的專屬性良好。

圖1 MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms

2.5 線性范圍和定量限

取空白血漿,分別加入混合對照品溶液適量,制成系列質(zhì)量濃度對照溶液,其中阿立哌唑的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200 ng·mL-1,脫氫阿立哌唑的質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20 ng·mL-1。按照2.3項下血漿樣品處理方法處理后,按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。分別以測得的阿立哌唑、脫氫阿立哌唑峰面積(Ai)與內(nèi)標(biāo)峰面積(As)的比值A(chǔ)i/As為縱坐標(biāo)(y),以阿立哌唑、脫氫阿立哌唑質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)最小二乘法線性回歸。阿立哌唑的回歸方程為y1=0.024x1+0.007,r=0.999 5,線性質(zhì)量濃度范圍為5～200 ng·mL-1,最低定量限質(zhì)量濃度為1 ng·mL-1;脫氫阿立哌唑的回歸方程為y2=0.021x2+0.003,r=0.999 2,線性質(zhì)量濃度范圍為0.5～20 ng·mL-1,最低定量限質(zhì)量濃度為0.2 ng·mL-1。

2.6 精密度和回收率實驗

取空白血漿100 μL,加入適量混合對照品溶液,制成低、中、高質(zhì)量濃度(每一質(zhì)量濃度平行操作3次)溶液,按照2.3項下血漿樣品處理方法處理后,按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。分別在1 d內(nèi)重復(fù)測定6 次,在3 d內(nèi)每日重復(fù)測定6次,計算日內(nèi)、日間精密度,測得量與加入量的比值為回收率。結(jié)果見表1。

表1 精密度、基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of precision,matrix effect and extraction recovery

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿100 μL,置于1.5 mL 離心管中,渦旋振蕩1 min,加入醋酸乙酯500 μL,渦旋振蕩3 min,在4 ℃以12 000 r·min-1高速離心10 min,取上清液,加入混合對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液適量,渦旋混勻1 min,制成低、中、高質(zhì)量濃度(每一質(zhì)量濃度平行操作3次)含基質(zhì)樣品。在37 ℃下用氮氣吹干,加入100 μL甲醇復(fù)溶,取5 μL,按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,阿立哌唑、脫氫阿立哌唑和內(nèi)標(biāo)的峰面積分別記作A1、A2和A3。另分別取混合對照品溶液適量,加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL,用甲醇稀釋制成低、中、高質(zhì)量濃度(每一質(zhì)量濃度平行操作3次)的對照品溶液,取5 μL 按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,阿立哌唑、脫氫阿立哌唑和內(nèi)標(biāo)物的峰面積分別記作B1、B2和B3。按照(Ai/Bi)×100%分別計算阿立哌唑、脫氫阿立哌唑和內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表1。

2.8 藥動學(xué)研究

雄性SD 大鼠40只,體質(zhì)量為(280±20) g,隨機(jī)分為5組,每組8只,給藥前禁食12 h,自由飲水。取阿立哌唑4種晶型樣品,置于研缽中研細(xì),過100目篩。精密稱取過篩樣品適量,用生理鹽水混懸后,迅速灌胃給予阿立哌唑2 mg·kg-1,分別于給藥后15、30 min及1、2、3、4、6、8、12、24、48 h取頸靜脈血0.3～0.4 mL,置于肝素潤洗過的離心管中,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液100 μL,置于1.5 mL 離心管中,按照2.3項下血漿樣品處理方法處理后,按照2.1項下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。計算不同時間點各晶型阿立哌唑及其活性代謝物脫氫阿立哌唑的血藥質(zhì)量濃度,繪制血藥質(zhì)量濃度-時間曲線,見圖2。

圖2 大鼠單劑量灌胃阿立哌唑不同晶型2 mg·kg-1后的平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線 (n=8)Fig.2 Plasma concentration-time curves in rats following a single dose intragastric administration of 2 mg·kg-1 of aripiprazole different crystal forms (n=8)

用DAS 2.0軟件,用二室模型對測得的血藥質(zhì)量濃度進(jìn)行藥代動力學(xué)參數(shù)的計算。用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以表示,組間比較用ANOVA 分析。阿立哌唑和脫氫阿立哌唑的藥代動力學(xué)參數(shù)見表2、表3。

表2 阿立哌唑的藥代動力學(xué)參數(shù) (,n=8)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of aripiprazole (,n=8)

表2 阿立哌唑的藥代動力學(xué)參數(shù) (,n=8)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of aripiprazole (,n=8)

注:與晶型α 比較,*P＜0.05。

表3 脫氫阿立哌唑的藥代動力學(xué)參數(shù) (,n=8)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of dehygroaripipracole (,n=8)

表3 脫氫阿立哌唑的藥代動力學(xué)參數(shù) (,n=8)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of dehygroaripipracole (,n=8)

注:與晶型α 比較,*P＜0.05。

由圖2A 和表2可知,大鼠分別單劑量灌胃給予阿立哌唑的4種晶型2 mg·kg-1后,新晶型組和晶型α組的阿立哌唑Cmax和AUC(0～48)顯著高于晶型Ⅳ組和倍半水合物組。表明新晶型和晶型α在體內(nèi)具有良好的吸收和生物利用度,這2種晶型在大鼠體內(nèi)的Cmax分別為(118.60±15.88)、(122.03±17.27)ng·L-1,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;AUC(0～48)相近,分別為(1 399.01±65.17)、(1 506.95±72.36) ng·L-1·h;新晶型組的tmax為(2.13±0.61) h,明顯短于晶型α組的(3.85±0.98) h(P＜0.05)。新晶型組和晶型α組的Cmax和AUC(0～48)均大于其他2種晶型,新晶型的吸收速度快于晶型α。

由圖2B和表3可知,大鼠分別單劑量灌胃給予阿立哌唑的4種晶型2 mg·kg-1后,新晶型組和晶型α組的脫氫阿立哌唑Cmax和AUC(0～48)顯著高于晶型Ⅳ和倍半水合物組。新晶型和晶型α的脫氫阿立哌唑Cmax分別為(11.67±1.88)、(12.08±1.33) ng·L-1,AUC(0～48)分別為(357.80±6.56)、(376.68±7.64)ng·L-1·h,均大于其他2種晶型;新晶型組的tmax為(7.69±0.12) h,短于晶型α組的(7.94±0.14) h(P＜0.05),表明新晶型在大鼠體內(nèi)的吸收速度快于晶型α,其代謝物脫氫阿立哌唑的速度也快于晶型α。

以上結(jié)果表明,不同晶型在大鼠體內(nèi)的吸收情況存在一定的差異。新晶型和晶型α的體內(nèi)生物利用度相近,均優(yōu)于其他晶型,且新晶型比晶型α吸收更快、起效更快。

3 討論

根據(jù)各國專利報道[10-17],阿立哌唑存在多晶型現(xiàn)象,不同晶型的粉末X 線衍射圖譜、差示掃描量熱曲線以及紅外光譜存在一定差異。目前,我國醫(yī)藥工業(yè)所采用的以及《中華人民共和國藥典》(2020年版二部)阿立哌唑原料項下所控制的晶型均為乙醇重結(jié)晶產(chǎn)物,即晶型α[18]。

阿立哌唑?qū)儆谏锼巹W(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類低溶解高滲透性藥物,提高藥物的溶解度和溶出速度可加快藥物的吸收。臨床上阿立哌唑的常用劑型為口腔崩解片,以促進(jìn)吸收、增加生物利用度。藥代動力學(xué)研究結(jié)果表明,大鼠口服阿立哌唑晶型α后的tmax約為3.85 h,與文獻(xiàn)[19-20]中的結(jié)果基本一致。不同晶型在大鼠體內(nèi)的吸收情況存在一定的差異。新晶型和晶型α的體內(nèi)生物利用度相近,均優(yōu)于其他晶型,但新晶型比晶型α吸收更快、起效更快,可作為工業(yè)生產(chǎn)中晶型α的替代晶型。