外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞和腫瘤標(biāo)志物在評估非小細(xì)胞肺癌患者化療后療效中的價值分析

林云恩，陳振楷，江麗雯，譚小軍，龍惠東（通信作者）

（1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 廣東 廣州 510095）

（2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科 廣東 廣州 510095）

（3 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 廣東 廣州 510095）

肺癌屬于呼吸系統(tǒng)一類常見惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中占比80%左右。早期準(zhǔn)確評估患者療效對調(diào)整治療方案、改善其預(yù)后有著重要意義。外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating Tumor Cell, CTC）是原發(fā)腫瘤生成后經(jīng)血液循環(huán)播散到遠(yuǎn)處器官后定植和增殖，對監(jiān)測抗腫瘤療效、預(yù)測預(yù)后有著重要價值。NSCLC 患者血清腫瘤標(biāo)志物水平改變和病情發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，通過檢測腫瘤標(biāo)志物水平能夠評估腫瘤患者的療效。本研究旨在探討CTC與腫瘤標(biāo)志物在評估該類患者化療后療效中的作用，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020 年1 月—2021 年9 月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治經(jīng)病理確診為NSCLC 的100 例患者的臨床資料，結(jié)合療效差異分成無效組（= 13）和有效組（= 87）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①存在胸痛、發(fā)熱、氣促、咯血以及干咳等癥狀，肺部CT、MRI、實驗室檢查存在異常，同時經(jīng)病理組織檢查確診為NSCLC 患者；②腫瘤TNM 分期在Ⅲ～Ⅳ期；③手術(shù)前未開展放化療或者分子靶向治療；④預(yù)估生存時間在3 個月以上；⑤入院時開展血常規(guī)、肝腎心功能檢查無異常，能耐受化療，同時于院內(nèi)接受不低于2 周期化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎心等重要臟器存在嚴(yán)重病或者伴隨免疫系統(tǒng)病者；②伴血液系統(tǒng)病或者其他惡性腫瘤者；③存在認(rèn)知或精神障礙等依從性不佳者。無效組男8 例，女5 例；年齡40 ～78 歲，平均年齡（58.45±4.36）歲；腫瘤直徑1.5 ～6.8 cm，平均（3.14±0.60）cm；有吸煙史7 例，無吸煙史6 例；合并糖尿病4 例，合并高血壓5 例，無合并疾病4 例。有效組男56 例，女31 例；年齡42 ～80 歲，平均年齡（58.64±4.20）歲；腫瘤直徑1.8 ～7.0 cm，平均（3.26±0.56）cm；有吸煙史52 例，無吸煙史35 例；合并糖尿病26 例，合并高血壓33 例，無合并疾病28 例。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），具有可比性。符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 方法

（1）治療方法。所有患者均通過TP 方案開展化療，150 mg/m紫杉醇，第1 天靜滴，采取紫杉醇前1 d的21:00 和當(dāng)日3:00 依次口服20 mg 地塞米松，使用藥物前30 min 肌注25 ～50 mg 異丙嗪，靜注300 mg 西咪替?。?0 mg/m順鉑，第1 ～3 d 靜滴。3 周是1 個療程，結(jié)束4 個療程化療后開展療效評定。（2）外周血中CTC 檢測。經(jīng)免疫磁珠法進(jìn)行CTC 分離富集，收集患者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周血5 mL，進(jìn)行48 h 靜置并離心5 min，選取上清液加入裂解液，將細(xì)胞混勻，離心處理棄去上清，再加裂解液，混勻、離心后棄去上清。對免疫磁珠顆粒進(jìn)行PBS 洗滌，按照每人份的鼠抗人EPCAM 抗體200 μL 與10 μL 加進(jìn)前期處理過的標(biāo)本內(nèi)混勻后孵化30 min，沖洗后離心5 min，棄去上清，加入PBS 到500 μL 和抗體標(biāo)記磁珠20 μL 進(jìn)行20 min 反應(yīng)。經(jīng)免疫熒光原位雜交對富集后細(xì)胞進(jìn)行檢測，CD45 抗體開展細(xì)胞免疫熒光檢測，經(jīng)8 號著絲探針開展熒光原位雜交。所有試劑盒均為江蘇萊爾生物醫(yī)藥提供。選取多通道熒光顯微鏡對細(xì)胞核進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，將8 號染色體異常的擴(kuò)增信號點(diǎn)＞2 個、CD45 陰性細(xì)胞評定成腫瘤細(xì)胞；CTC 數(shù)量≥2 個評定成CTC 陽性。（3）腫瘤標(biāo)志物檢測。收集患者空腹?fàn)顟B(tài)下的3 ～5 mL 靜脈血，離心處理后分離得到血清，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法對血清癌胚抗原（carcino embryonic antigen, CEA）、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（SCC）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）及人細(xì)胞角蛋白21-1 片段（human cytokeratin fragment antigen 21-1，Cyfra21-1）水平開展檢測，試劑盒為賽默飛世爾公司提供，操作者嚴(yán)格依據(jù)說明書內(nèi)容進(jìn)行操作。各項指標(biāo)正常值：CEA＜5.0 ng/mL；SCC ＜1.5 ng/mL；NSE ≤15.2 ng/mL；Cyfra21-1 ≤4.0 ng/mL。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）療效評定標(biāo)準(zhǔn)。全部緩解（complete remission,CR）：病灶全部消失，未觀察到新的病灶產(chǎn)生，且腫瘤的最長直徑減小不低于50%，時間維持不低于4 周；部分緩解（partial response, PR）：病灶面積減?。?0%，同時時間維持不低于4 周；穩(wěn)定（stable disease, SD）：病灶縮小面積在30%以下或者增加＜20%；進(jìn)展（progressive disease, PD）：病灶面積增加超出20%，或有新病灶產(chǎn)生。本研究CR 和PR 劃分到治療有效，SD 和PD 劃分到治療無效。（2）觀察無效組、有效組外周血中CTC 陽性率和腫瘤標(biāo)志物水平差異，將有差異資料帶入logistic 回歸方程計算，分析影響NSCLC 患者療效的主要因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 影響NSCLC 患者化療后療效的單因素分析

兩組TNM 分期、外周血中CTC 陽性率、血清CEA、CA125、NSE、Cyfra21-1 水平存在顯著差異（＜0.05），見表1。

表1 影響非小細(xì)胞肺癌患者化療后療效的單因素分析

表1（續(xù)）

2.2 影響NSCLC 患者化療后療效的多因素分析

將單因素分析有統(tǒng)計學(xué)差異的變量納入多因素Logistic 回歸分析。其中自變量若為連續(xù)性變量以原數(shù)值納入，分類變量兩組TNM 分期、外周血中CTC 陽性率賦值方式為。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，高外周血中CTC 陽性率、高血清CEA 水平、高血清SCC 水平、高血清NSE 水平以及高血清Cyfra21-1 水平是影響NSCLC 患者化療后療效的主要因素（＜0.05，OR ＞1），見表2。

表2 影響非小細(xì)胞肺癌患者化療后療效的多因素分析

3.討論

CTC 是腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移一個重要的條件，經(jīng)臨床證實和NSCLC 患者臨床病理以及生存時間有關(guān)。腫瘤標(biāo)志物指的是腫瘤于發(fā)生及發(fā)展期間生成或者分泌同時釋放至外周中的肽類物質(zhì)，檢測血清中腫瘤標(biāo)志物能被應(yīng)用到惡性腫瘤診斷、療效判斷及預(yù)后評估中。本研究分析外周血中CTC、血清CEA、SCC、NSE、Cyfra21-1和NSCLC 患者化療后療效的關(guān)系，以期為臨床制定化療方案提供指導(dǎo)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療有效組、無效組在TNM 分期、外周血中CTC 陽性率、血清CEA、SCC、NSE、Cyfra21-1 水平方面存在顯著差異（＜0.05），將有差異資料帶入Logistic 回歸方程計算，結(jié)果顯示，高外周血中CTC 陽性率、高血清CEA 水平、高血清SCC 水平、高血清NSE水平以及高血清Cyfra21-1 水平是影響NSCLC 患者療效的主要因素（＜0.05），這和李曉華等研究結(jié)果一致。

由此得出以下結(jié)論。（1）外周血中CTC 陽性率：CTC 的存在給惡性腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展、增殖帶來了條件，外周血中CTC 陽性率較高。提示機(jī)體腫瘤負(fù)荷高，機(jī)體的免疫清除能力較低，會影響患者療效。因此，外周血中的CTC 陽性率越高，提示患者療效越差。（2）腫瘤標(biāo)志物水平：CEA 是糖蛋白分子，于細(xì)胞表面廣泛存在，主要負(fù)責(zé)癌細(xì)胞和癌細(xì)胞基質(zhì)膠原間黏附反應(yīng)，是臨床應(yīng)用較多的一類腫瘤標(biāo)志物，其水平越高，說明NSCLC患者病情越嚴(yán)重；SCC 屬于鱗狀上皮癌重要標(biāo)志物，常被臨床用于鱗狀上皮來源腫瘤的輔助診斷中；NSE是神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)元細(xì)胞中特異性的酸性蛋白酶物質(zhì)，對腫瘤診斷和篩查有著重要作用，動態(tài)監(jiān)測其水平可提示腫瘤有無出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)；Cyfra21-1 為上皮細(xì)胞在凋亡過程中，細(xì)胞中角蛋白碎片通過降解生成的可溶性物質(zhì)，能直接到達(dá)血液中使血液內(nèi)含量增多；NSCLC患者的血清Cyfra21-1 水平存在異常升高，是NSCLC 一類主要的診斷標(biāo)志物。血清中的CEA、SCC、NSE、Cyfra21-1 水平越高，提示患者的療效越不理想。

綜上所述，外周血中CTC 高陽性表達(dá)和血清CEA、SCC、NSE 以及Cyfra21-1 高表達(dá)是NSCLC 患者化療無效的主要因素，結(jié)合上述指標(biāo)能為評估NSCLC 患者化療后療效提供重要依據(jù)。