藥品中需氧菌總數(shù)能力驗證不滿意結(jié)果的OOS分析

王立云 楊曉云 牛萌萌 姬俊

（青島市食品藥品檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局海洋中藥質(zhì)量研究與評價重點實驗室 山東 青島 266071）

1 前言

出具準(zhǔn)確可靠的檢測數(shù)據(jù)，不斷提升檢測能力是實驗室運行的基礎(chǔ)[1]，加強內(nèi)部質(zhì)量控制，參與外部能力驗證是評價實驗室檢測能力的重要手段[2]，能夠幫助實驗室識別風(fēng)險。

本實驗室參與2021年度藥品需氧菌總數(shù)的能力驗證，在3個樣品中出現(xiàn)1個不滿意結(jié)果（樣品1），2個滿意結(jié)果（樣品2、3），按照實驗室認可質(zhì)量體系的要求，對不滿意結(jié)果的糾正與預(yù)防措施（Corrective Action and Protective Action，CAPA）立即全過程啟動[3]，本文對此進行分析。

2 處理過程

2.1 啟動《不符合檢驗工作控制程序》

本實驗室立即啟動《不符合檢驗工作控制程序》，填寫《不符合工作處理單》，終止該項目的檢驗工作，并及時向質(zhì)量控制部門報告情況，申請進一步識別并獲準(zhǔn)停止該項工作的正式許可，分析不滿意結(jié)果產(chǎn)生的根本原因，梳理近半年的檢驗報告和原始記錄，提出糾正措施并實施[4-5]。

2.2 原因分析

按照《中國藥典》2020版中“9203藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則”，從人員、樣品、設(shè)施環(huán)境等因素進行逐一排查，最終確定引起不滿意結(jié)果的原因。

（1）人員。3名檢驗人員均經(jīng)過上崗培訓(xùn)并取得資格證，有多年微生物檢驗工作經(jīng)驗。本次實驗有3批樣品，每人分別負責(zé)1批樣品的開啟、溶解，并制備待測溶液，同時進行3份樣品的稀釋、加培養(yǎng)基等操作，因3人的計數(shù)結(jié)果一致，故初步排除人員的問題。

（2）培養(yǎng)基。該試驗采用本實驗室常用的國內(nèi)A廠家的TSA成品培養(yǎng)基，在購入后曾進行驗收，結(jié)果為合格，且密閉儲存于設(shè)有除濕機的房間，實驗前現(xiàn)配，滅菌后調(diào)節(jié)pH。采用中檢院的胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基（用于需氧菌總數(shù)計數(shù)適用性檢查或檢驗）作為比對培養(yǎng)基，結(jié)果與A廠家培養(yǎng)基一致，由結(jié)果報告可知，試驗分到的樣品中2份為同批次樣品，1份結(jié)果滿意，1份結(jié)果不滿意，故可排除培養(yǎng)基的問題。

（3）試劑。該試驗采用國內(nèi)A廠家生產(chǎn)的pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，每瓶500 mL，臨用現(xiàn)開。

（4）菌種。該試驗未做陽性對照，所用的TSA培養(yǎng)基為日常備用，曾多次驗證（加標(biāo)回收），均符合《中國藥典》2020年版的要求，最近一次使用距離該實驗未超過10 d，以空白培養(yǎng)基為陰性對照。

（5）設(shè)備。該試驗所用培養(yǎng)箱為INE-500型培養(yǎng)箱，2021年3月1日由青島市計量院進行檢定及校正，試驗前用外置溫度計對數(shù)顯屏幕上的溫度進行核對，故可排除培養(yǎng)條件的問題。

（6）設(shè)施和環(huán)境條件。由結(jié)果報告可知，為考察實驗室在檢驗過程中是否由于環(huán)境設(shè)施、操作等污染樣品，故樣品3中未添加菌種，本實驗室檢測樣品3無菌，為滿意結(jié)果，可以反證設(shè)施及環(huán)境條件符合要求。

（7）樣品及檢驗方法。該試驗樣品為3瓶分別置于安瓿瓶中的乳白色冷凍干燥物，收到樣品后第一時間置于-20℃度冰箱中保存，檢測前將樣品平衡至室溫。制備待測溶液時，為避免轉(zhuǎn)移損失，未進行轉(zhuǎn)移操作，直接向安瓿瓶中加入10 mL pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，充分混勻后完全溶解成乳白色均一溶液，作為待測供試品（10 mL）；按作業(yè)指導(dǎo)書中“室溫放置15 min”（為細菌能夠充分復(fù)蘇），再次混勻，進行10倍稀釋，取待測液1 mL置于9 mL pH 7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中；分別取待測供試液原液、1∶10液、1∶100液1 mL置于培養(yǎng)皿中，加入配置好的溫度低于45℃的TSA培養(yǎng)基，混勻，靜置；待培養(yǎng)基凝固后置于32.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日點計。該試驗過程較簡單，偏差不應(yīng)來源于此。

（8）結(jié)果計算及報告。該試驗有2處易被忽視的細節(jié)：未注意作業(yè)指導(dǎo)書中對待測溶液的規(guī)定，誤認為第一步稀釋的溶液是1∶10溶液，而將上報結(jié)果擴大了10倍，即cfu/g，實際應(yīng)為cfu/mL；數(shù)據(jù)上報應(yīng)取菌落數(shù)小于300的稀釋級別[6]，計算后取2位有效數(shù)字。

由結(jié)果報告可知，樣品1和2為同批樣品，添加約103～104cfu的微生物。在統(tǒng)計本次能力驗證結(jié)果時，該樣品的結(jié)果中位值為1 500；在考察樣品均勻性和穩(wěn)定性時，該樣品的含菌量約為1 000，本實驗室的結(jié)果偏低，樣品3中未添加微生物，結(jié)果見表1。

表1 能力驗證結(jié)果

進一步分析原始數(shù)據(jù)（見表2），樣品1、2由原液到1∶1 000的10倍稀釋液中計數(shù)存在異常，前者含菌量明顯偏低，未成梯度趨勢。此時按照藥典中取平均最高菌落數(shù)計算后的數(shù)值上報，結(jié)果與實際含菌量不符。在1∶100稀釋級得到的結(jié)果是樣品1、2中均含有1 400、1 500cfu/mL的微生物，說明樣品中的含菌量達到1 000以上，原液或1∶10溶液得到的結(jié)果偏低，應(yīng)是菌落未長出或未被計數(shù)。若高稀釋度平板上的菌落數(shù)更高，則說明檢驗過程出現(xiàn)差錯或樣品中含抑菌物質(zhì)，不滿意結(jié)果的原因應(yīng)在于此。

表2 能力驗證原始數(shù)據(jù)

該試驗樣品中添加的微生物包含金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003）、（CMCC 63303）和白色念珠菌（CMCC（F）98001）。蠟樣芽孢桿菌的菌落較大，表面粗糙、扁平、不規(guī)則，在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤、直徑5～7 mm的白色菌落（似蠟燭樣顏色）。白色念珠菌則生長較慢，部分菌落48 h才肉眼可見，若平板上的微生物多，可能會造成菌落覆蓋或重疊，雖逐日點計，但易被漏數(shù)，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

綜上所述，可以確定本次能力驗證不滿意結(jié)果的原因是原液或1∶10溶液菌落未長出或未被計數(shù)，未經(jīng)過全面分析，照搬中國藥典的菌落計數(shù)規(guī)則上報結(jié)果造成的。

3 糾正措施

當(dāng)參加能力驗證活動結(jié)果為不滿意或可疑時，按照本院質(zhì)量管理體系要求，應(yīng)立即進行檢驗結(jié)果偏差（Out of Specification，OOS）分析，制定糾正與預(yù)防措施（Corrective Action and Protective Action，CAPA）[7-8]，并通過參加測量審核，再次進行考察直至取得滿意結(jié)果。

（1）人員培訓(xùn)。對所有試驗人員進行《中國藥典》2020年版四部《1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》《中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2019年版的培訓(xùn)，重新梳理知識體系，提高人員檢驗水平。

（2）檢測檢品。調(diào)取留樣，特別是距離該試驗最近一次驗證的樣品，重新對其進行回收試驗，結(jié)果均在0.5～2.0之間，重新進行微生物限度檢查，2次結(jié)果均一致，詳見表3。

表3 能力驗證前后同批次檢品實驗驗結(jié)果對比

（3）實驗室比對。從其他實驗室調(diào)取樣品進行比對試驗，結(jié)果均一致。

（4）參加測量審核。立即報名參加藥品中需氧菌總數(shù)測量審核，3批樣品均得到滿意結(jié)果。

4 監(jiān)督、跟蹤、恢復(fù)檢驗

糾正措施實施后，由質(zhì)量監(jiān)督員進行跟蹤驗證，確認各項糾正措施是否落實到位并按要求完成，檢查實施情況是否有完整記錄[8]。符合要求后，恢復(fù)檢驗工作，在下次的監(jiān)督檢查中還要進—步跟蹤驗證。嚴(yán)格審查糾正措施的可行性和有效性，對反復(fù)出現(xiàn)的問題加大審核的頻次和力度[9]。

5 討論

本次能力驗證的組織方共制備了3種濃度6批樣品，分別為能力驗證樣品A1、A2，B1、B2，C1、C2，合計制備樣品總數(shù)為955瓶。樣品A1、A2添加約105cfu的微生物，樣品B1、B2添加約103～104cfu的微生物，樣品C1、C2不添加微生物。組織方向每個實驗室發(fā)放3份樣品，為保證考核難度的均衡性，均包含1份樣品C1或C2，剩余2份樣品從樣品A1、A2、B1、B2中隨機抽取。

本次能力驗證中，170家實驗室的結(jié)果為滿意，占比76.2%；10家實驗室結(jié)果為可疑，占比4.5%；43家實驗室結(jié)果為不滿意，占比19.3%。經(jīng)統(tǒng)計，A、B這2類樣品中，有62份樣品得到可疑或不滿意的結(jié)果，其中B2樣品的可疑或不滿意率占比33.87%，C類樣品未計入，結(jié)果見表4。可見B類樣品的可疑或不滿率大于A類樣品。這可能與樣品中微生物的數(shù)量有關(guān)，8月中下旬我國大部分地區(qū)高溫高濕，微生物易受運輸、溫度等條件的影響。

表4 樣品A1、A2、B1、B2（可疑+不滿意）占比

能力驗證是實驗室質(zhì)量控制的重要手段之一，是評價實驗室技術(shù)能力的重要依據(jù)，實驗室通過有目的、有計劃地參加能力驗證，可提高檢驗人員的檢驗?zāi)芰ΑＨ魏我粋€步驟出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致最終結(jié)果的偏離，因此驗證結(jié)束后，組織方會提供詳細的《能力驗證結(jié)果報告》，對本次計劃的關(guān)鍵技術(shù)要點進行詳盡分析，能夠促進檢驗水平的提升[10]。能力驗證的結(jié)果若出現(xiàn)可疑或不滿意，應(yīng)當(dāng)通過糾正與預(yù)防措施（CAPA）查找原因，并進行整改，以提升實驗室的檢驗?zāi)芰凸芾硭健?/p>