人參歸脾丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李正剛 李本淳 王路宏 王丹彧 趙艷 馬彧*

（1.四平市食品藥品檢驗所 吉林 四平 136000；2.吉林省藥品檢驗研究院）

1 前言

人參歸脾丸由人參、黃芪（蜜炙）、當(dāng)歸、木香、茯苓等10味中藥組成，具有益氣補血、健脾養(yǎng)心之功效，常用于治療心脾兩虛、氣血不足所致的心悸怔忡、失眠健忘、食少體倦、面色萎黃，以及脾不統(tǒng)血所致的便血、崩漏、帶下等。其標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第四冊[1]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅收載了顯微鑒別和當(dāng)歸薄層鑒別，無含量測定項，不利于質(zhì)量控制。本文經(jīng)前期文獻調(diào)研[2-9]，建立處方中人參、當(dāng)歸和木香3味藥材的薄層色譜（TLC）定性鑒別方法，并采用高效液相色譜法對黃芪甲苷的含量進行測定，以期為人參歸脾丸的質(zhì)量控制提供可靠的方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與材料

電子天平（BT125D型，0.1 mg，北京賽多利斯儀器天平有限公司）；HPLC-ELSD色譜儀（Agilent 1260型，配Agilent 1260 II型蒸發(fā)光散射檢測器，美國Agilent公司）；超聲儀（KQ-500VDE型，昆山市超聲儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

黃芪甲苷（批號：110781-201717，純度96.9%）、人參皂苷Rg1（批號：110703-201933）、人參皂苷Rb1（批號：110704-201928）、人參皂苷Re（批號：110754-202028）、人參（批號：120917-201712）、當(dāng)歸（批號：120927-201617）、木香（批號：120921-201309）對照品和對照藥材（中國食品藥品檢定研究院）；人 參 歸 脾 丸 （批 號：20190801、20190901、20190902、20190903，吉林一正藥業(yè)集團有限公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)lsher Scientific公司）；甲醇、氯仿、正丁醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水（超純水）。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 TLC定性鑒別

2.2.1.1 人參

取樣品適量，研細(xì)，稱取約15g；加入甲醇150 mL，超聲處理30 min，放置過夜；超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液100 mL，蒸干；加水30 mL使其溶解，移置分液于漏斗中；蒸發(fā)皿用水5 mL洗滌，洗液并入分液漏斗中；用氯仿提取3次，每次30 mL，棄去；水層用正丁醇提取5次（40、40、30、30、20 mL），合并正丁醇液；用氨試液洗滌3次，每次100 mL，棄去氨試液；用水洗滌2次，每次80 mL；正丁醇液蒸干，殘渣加水15 mL使其溶解；轉(zhuǎn)移至D101型大孔吸附樹脂柱上，用水60 mL洗脫；用40%乙醇30 mL洗脫，用70%乙醇60 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液蒸干；用甲醇1.5 mL將殘渣溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中；加入甲醇，稀釋至刻度，作為樣品溶液。

稱取人參對照藥材2.0 g，采用相同方法制備成人參對照藥材溶液。稱取人參皂苷Re、Rb1、Rg1對照品各2 mg，置于同一2 mL量瓶中，用甲醇溶解制成混合對照品溶液。按照人參歸脾丸處方比例和工藝，制得人參陰性樣品，再按樣品溶液制備方法操作，制得人參陰性對照溶液。

吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲醇—氯仿—醋酸—水（6∶5∶0.5∶2）的下層溶液為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃顯色。結(jié)果顯示，樣品在與人參對照藥材和人參皂苷Re、Rb1、Rg1對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點，且人參陰性無干擾，典型色譜圖見圖1。

圖1 人參TLC色譜圖

2.2.1.2 當(dāng)歸

取樣品適量，研細(xì)，稱取約6 g；加入氯仿50 mL，加熱回流1h；濾過，濾液蒸干，用甲醇1 mL溶解殘渣，作為樣品溶液。稱取當(dāng)歸對照藥材0.5g，采用相同方法制成當(dāng)歸對照藥材溶液。按照人參歸脾丸處方比例和工藝，制得當(dāng)歸陰性樣品，再按樣品溶液制備方法操作，制得當(dāng)歸陰性對照溶液。

吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯—正已烷（1：9）為展開劑，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果顯示，樣品在與當(dāng)歸對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點，且當(dāng)歸陰性無干擾，典型色譜圖見圖2。

圖2 當(dāng)歸TLC色譜圖

2.2.1.3 木香

取樣品適量，研細(xì)，稱取約6 g；加入氯仿50 mL，回流1 h；濾過，濾液蒸干，用甲醇1 mL溶解殘渣，作為樣品溶液。稱取木香對照藥材1 g，加甲醇30 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解，作為對照藥材溶液。按照人參歸脾丸處方比例和工藝，制得木香陰性樣品，再按樣品溶液制備方法操作，制得木香陰性對照溶液。

吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-正已烷（3∶10）為展開劑，噴以10%香草醛硫酸溶液，加熱使斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，樣品與木香對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點，且木香陰性無干擾，典型色譜圖見圖3。

圖3 木香TLC色譜圖

2.3 黃芪甲苷含量測定

2.3.1 色譜條件

Zafex Supfex JX-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫；洗脫程序：0～60 min，30%～30%A；60～65 min，30%～50%A；65～75 min，50%～90%A；75～76 min，90%～30%A；76～85 min，30%～%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）參數(shù)：霧化管溫度：50℃，漂移管溫度：90℃，載氣流量：1.5 L/min，載氣：氮氣；進樣量：10 μL。

2.3.2 樣品處理

2.3.2.1 對照品溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻。

2.3.2.2 樣品溶液制備

稱取樣品15 g（精確至0.000 1 g），精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液100 mL，密塞，稱定重量；加熱回流2 h，放冷，稱定重量；用80%甲醇溶液進行補重，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液50 mL，回收溶劑至干，加水50 mL溶解殘渣；用正丁醇提取5次，每次50 mL；合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次50 mL；正丁醇液回收溶劑至干，用80%甲醇溶解殘渣；轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，即得。按照人參歸脾丸處方比例和工藝，制得黃芪陰性樣品，再按樣品溶液制備方法操作，制得黃芪陰性對照溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取“2.3.2”項各溶液，按照“2.3.1”項色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，黃芪甲苷與其他成分均達到基線分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)均≥10 000，陰性無干擾。

圖4 液相色譜圖

2.3.4 線性范圍考察

精密稱取黃芪甲苷對照品10.16 mg，置于20 mL容量瓶中；用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取2、5、7.5、10、15、20 μL注入液相色譜儀進行測定。以對照品進樣質(zhì)量m（μg）的對數(shù)lgm為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積的對數(shù)lgA為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃芪甲苷回歸方程為：y=1.7649x+2.6111，r=0.999 8。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.985 μg～9.845 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察

取同一樣品溶液，于0、1、4、8、16、24 h分別進行測定。結(jié)果顯示，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，黃芪甲苷的RSD為2.6%。

2.3.6 重復(fù)性考察

取同一批號樣品，平行制備6份樣品溶液，同法測定，黃芪甲苷含量為103.3 μg/g，RSD為1.4%。

2.3.7 回收率考察

取已知含量的樣品（批號：20190801）6份，每份約7.5 g，精密稱定，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液100溶液（濃度7.49 μg/溶液），按“2.3.2.2”樣品溶液制備方法，制成供試品溶液進行測定，回收率結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3.8 樣品測定

取4份不同批號的樣品，按“2.3.2.2”項的方法進行處理，并計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

本文對樣品回流提取時間進行了考察，分別考察回流1、2、4 h，結(jié)果分別為100.8、103.3、103.7 μg/g，可見回流2 h基本可以提取完全。經(jīng)查閱文獻[6-10]和實驗考察，樣品經(jīng)過D101大孔吸附樹脂的損失較大，在國產(chǎn)色譜柱和進口色譜柱均能達到有效分離的情況下，為確保實驗準(zhǔn)確，可以不進行過柱凈化。

人參為人參歸脾丸處方中的君藥，對人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re含量亦進行了多種測定方法的考察，包括不同提取方法和液相檢測方法，如HPLC-UV法和HPLC-ELSD法，陰性樣品均有干擾。經(jīng)查閱文獻，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道，故本文采用薄層色譜進行質(zhì)量控制。

人參歸脾丸是常用的中成藥，屬于國家醫(yī)保目錄產(chǎn)品，生產(chǎn)廠家眾多。現(xiàn)階段其臨床研究報道較多，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較少，難以保證其產(chǎn)品質(zhì)量，本文的研究成果可以為人參歸脾丸的質(zhì)量控制提供參考。