需氧菌總數(shù)能力驗證的結(jié)果與分析

湯曼莉 吳愫青 楊玉玲 李輝

（珠海市食品藥品檢驗所 廣東 珠海 519090）

1 前言

能力驗證是利用實驗室間的比對，按預(yù)先制訂的準(zhǔn)則評價參與者能力的活動[1-2]，有助于實驗室進行質(zhì)量控制、完善管理制度，評價檢測水平[3]。2021年，本實驗室參與了由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心組織并提供樣品的《需氧菌總數(shù)能力驗證測量審核》能力驗證活動，本文分析和總結(jié)能力驗證結(jié)果，以期為相關(guān)人員提供參考。

2 材料與方法

2.1 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：1103601，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；pH氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：1090981，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；紅四氮唑（TTC，批號：C10105859，上海麥克林生化科技有限公司）。滅菌水由本實驗室純化水系統(tǒng)自制。

2.2 儀器與設(shè)備

脈動真空滅菌器（BiST-A-D360D-A型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；培養(yǎng)箱（BRE 240型，F(xiàn)roilabo）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A型，上海申賢恒溫設(shè)備廠）；生物安全柜（1379型，Thermo）。

2.3 測試樣品

非無菌藥品中需氧菌總數(shù)檢測樣品（編號：MA21-R347，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心）。

2.4 檢驗方法

按照組織方下發(fā)的《測量審核作業(yè)指導(dǎo)書》和《中國藥典》2020年版四部“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”的要求進行檢驗。樣品開啟后加入20 ml無菌水進行復(fù)溶，待充分溶解后作為供試品原液（100）進行檢驗，設(shè)置4個梯度稀釋級別（100、10-1、10-2、10-3），每個級別設(shè)置2個平行平皿。安排3位檢驗人員按照上述方法，進行平行操作檢驗，各自獨立完成操作、計數(shù)、計算和檢驗報告撰寫等工作。

2.5 平板計數(shù)與z值計算

2.5.1 平板計數(shù)

3位檢驗人員分別在24 h、48 h、72 h對平板進行觀察、計數(shù)，并記錄結(jié)果，換算成樣品中的需氧菌總數(shù)。

2.5.2 z值的計算

樣品的測試結(jié)果采用“z-比分數(shù)”評價，z比分數(shù)計算公式如式（1）所示。

式中：x——測試人提供的測試結(jié)果；X——指定值/對數(shù)值（中位值）；σ——標(biāo)準(zhǔn)差（樣品的標(biāo)準(zhǔn)化四分位間距）。當(dāng)|z|≤2時，結(jié)果判定為“滿意”；當(dāng)2＜|z|＜3時，結(jié)果判定為“可疑”；當(dāng)|z|≥3時，結(jié)果判定為“不滿意”。

3 結(jié)果與分析

3.1 平板計數(shù)結(jié)果

選取菌落數(shù)在50～300 cfu的平板，作為最終計數(shù)結(jié)果，樣品MA21-R347及空白對照在TSA平板上的計數(shù)結(jié)果見表1、表2和表3。

表2 檢驗人員2的平板計數(shù)結(jié)果

表3 檢驗人員3的平板計數(shù)結(jié)果

通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)樣品原液，即100級別菌落數(shù)量過多，無法計數(shù)；10-2、10-3級別菌落數(shù)過少，2個平行平皿間出現(xiàn)較大的計數(shù)差異，易導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確；10-1級別菌落在300～400 cfu之間，更適合作為計數(shù)平皿。因此，選擇10-1級別平皿計數(shù)的菌落報告結(jié)果。

通過觀察發(fā)現(xiàn)：48 h時，平板上的菌落生長過于旺盛，菌落變大、融合成片，嚴重影響計數(shù)；72 h時，100、10-1、10-2這3個級別的平皿上，菌落幾乎完全融合成片，無法計數(shù)。因此，3位檢驗人員的計數(shù)結(jié)果均采用培養(yǎng)24 h的結(jié)果，詳見表1。

表1 檢驗人員1的平板計數(shù)結(jié)果

為觀察培養(yǎng)基中加入TTC（濃度0.001%）與不加入TTC對檢驗人員觀察結(jié)果的影響，檢驗人員1同時制備1份平行樣品，采用不加入TTC的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，計數(shù)結(jié)果見表4?？梢娕囵B(yǎng)基中未加TTC的平皿上，生長的菌落稍大一些，出現(xiàn)了不易辨別的碎屑狀物質(zhì)，增加了菌落計數(shù)的難度。

表4 檢驗人員1采用不加入TTC的培養(yǎng)基的檢驗結(jié)果

3.2 實驗結(jié)果的確定與評價

本次能力驗證實驗的最終結(jié)果，以檢驗人員1的結(jié)果上報：3 400 CFU/mL。根據(jù)組織方提供的結(jié)果報告，本實驗室收到的樣品，編號：MA21-R347，其指定值（對數(shù)形式）：3.543 log10 CFU/mL；能力評定標(biāo)準(zhǔn)差σ：0.125 log10 CFU/mL。因此，本實驗室的結(jié)果為“滿意”（3 400 CFU/mL，對數(shù)形式：3.531 log10 CFU/mL，z值：-0.1）。

根據(jù)組織方報告中的指定值，人員和方法比對試驗結(jié)果的z值見表5。

表5 試驗結(jié)果與z值統(tǒng)計表

4 討論

本實驗室參加了中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心的非無菌藥品中需氧菌總數(shù)能力驗證，根據(jù)《測量審核作業(yè)指導(dǎo)書》和《中國藥典》2020年版四部“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”的要求進行檢驗，最終得到滿意結(jié)果，說明本實驗室具備檢驗非無菌藥品中需氧菌總數(shù)檢驗?zāi)芰Α?/p>

在檢驗中，本實驗室采用了多個稀釋級別、平行樣、人員比對、方法比對等方式，從不同方面驗證了本實驗室需氧菌總數(shù)檢驗計數(shù)的準(zhǔn)確性，并考察了本實驗室檢驗人員之間的技術(shù)能力差異。結(jié)果表明，本實驗室的3位檢驗人員均能獨立完成實驗并出具檢驗報告，其檢驗結(jié)果|z|值均為“滿意”，人員之間的誤差也較小。

另外，本實驗室還采取了同一檢驗人員對同一檢品分別使用含有0.5% TTC的培養(yǎng)基和不含有TTC的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，來進行檢驗方法比對，2種方法的|z|值均＜2，結(jié)果為“滿意”。而使用不含有TTC的培養(yǎng)基時，計數(shù)結(jié)果略大于使用含有0.001%TTC的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的結(jié)果。有文獻報道紅四氮唑（TTC）具有抑制某些革蘭氏陽性菌生長的作用，可防止菌落蔓延，有助于菌落總數(shù)的計數(shù)觀察[4-5]。因此出現(xiàn)這一結(jié)果，可能是由于在不使用TTC對菌落進行染色時，菌落本身的顏色與培養(yǎng)基的顏色相近，對部分微小的碎屑狀物質(zhì)無法進行準(zhǔn)確判斷，從而產(chǎn)生計數(shù)誤差。

據(jù)蔡愛君[6]報道，在微生物檢驗中使用TTC法檢出總菌落數(shù)顯著優(yōu)于其他方法，而我們在實際檢驗過程中也發(fā)現(xiàn)每1 000 mL培養(yǎng)基加入1 mL濃度為1% TTC后，計數(shù)更便利，準(zhǔn)確性也有所提高。

本實驗室在此之前參與的由中國食品藥品檢定研究院組織的“藥品中需氧菌總數(shù)計數(shù)能力驗證計劃NIFDC-PT-340”，取得了不滿意的結(jié)果，本文通過分析總結(jié)出一些經(jīng)驗：必須嚴格遵循檢驗程序，檢驗前仔細閱讀《作業(yè)指導(dǎo)書》；檢驗過程中報告審核者和實際檢驗人員應(yīng)加強交流，及時發(fā)現(xiàn)問題；應(yīng)對樣品進行合理稀釋；注重人員比對，提高準(zhǔn)確率；選用合適的計數(shù)方法，并進行計數(shù)復(fù)核。