乳粉中微生物檢測的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果分析

林雙慶 王仍瑞 許秋貝 鄭小文 楊玉貞

（廈門海關(guān)技術(shù)中心 福建 廈門 361000）

1 前言

實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是指按照預(yù)先規(guī)定的條件，由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類似的樣本進(jìn)行檢測的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)[1]，可作為能力驗(yàn)證的補(bǔ)充，強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，是多種外部質(zhì)量控制的方法之一。漳州市是福建省出口食品農(nóng)產(chǎn)品的重要城市，2015年其食品農(nóng)產(chǎn)品出口量居全國地級(jí)市首位[2]。本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)評(píng)價(jià)了漳州地區(qū)以出口為主的63家食品企業(yè)的微生物檢測能力，以幫助企業(yè)內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室查找日常檢測工作中存在的問題，制定相應(yīng)措施以保持或提升其微生物檢測能力。本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)共涉及6個(gè)微生物檢測項(xiàng)目，2個(gè)定量項(xiàng)目包括菌落總數(shù)和大腸菌群，4個(gè)定性項(xiàng)目包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱（F-0.5P，日本醫(yī)化儀器公司）；全自動(dòng)微生物鑒定儀（VITEK2 Compact 30，法國生物梅里埃公司）；生物安全柜（HF1200，上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；冷凍干燥機(jī)（LFD5508，韓國DAIHAN LABTECH公司）；高壓滅菌鍋（VB-95，德國SYSTEC公司）；TSA固體培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基、BPW液體培養(yǎng)基，APW液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；NaN3、海藻糖、谷氨酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.85%無菌生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）；表皮葡萄球菌（CMCC26069）；副溶血性弧菌（ATCC17802）；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）；英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）；大腸埃希氏菌（ATCC25922）；陰溝腸桿菌（CICC 21539）。菌株均來自專業(yè)機(jī)構(gòu)保存的可溯源標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.3 方案設(shè)計(jì)

按參試實(shí)驗(yàn)室所報(bào)項(xiàng)目發(fā)放樣品，定量項(xiàng)目隨機(jī)發(fā)放1份考核樣品，定性項(xiàng)目隨機(jī)發(fā)送2份考核樣品（陰性樣本或陽性樣本），每份樣品對(duì)應(yīng)1個(gè)唯一編號(hào)。參試實(shí)驗(yàn)室按《乳粉中微生物項(xiàng)目比對(duì)實(shí)驗(yàn)參試指導(dǎo)書》進(jìn)行樣品接收、檢測和結(jié)果報(bào)送。方案同時(shí)賦予每個(gè)實(shí)驗(yàn)室1個(gè)代碼，結(jié)果分析和能力評(píng)價(jià)均以實(shí)驗(yàn)室代碼表示。

2.4 樣品制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株在BHI液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，增菌備用（副溶血性弧菌在APW液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇）；在含有保護(hù)劑的乳粉基質(zhì)中添加預(yù)定濃度的目標(biāo)菌懸液（部分項(xiàng)目添加背景干擾菌），充分混勻，裝入西林瓶，冷凍干燥后完成制備。

菌株添加前需進(jìn)行菌株純度和關(guān)鍵生化特性驗(yàn)證；基質(zhì)、保護(hù)劑和西林瓶等樣品制備所需試劑耗材需經(jīng)無菌處理，并在無菌環(huán)境中完成樣品制備；致病菌樣品在相應(yīng)的生物安全等級(jí)區(qū)域完成制備。

2.5 檢測方法

建議檢測方法為GB4789系列國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)[3-8]。

2.6 均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

樣品均勻性檢驗(yàn)方法：樣品分裝后，隨機(jī)抽取10份樣品，每份樣品重復(fù)測試2次，定性樣品的測試結(jié)果均與樣品指定值（陽性或陰性）一致時(shí)，說明該樣品符合要求。定量樣品依據(jù)CNAS-GL003：2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》中的單因子方差分析法（F檢驗(yàn)法）進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)[9]。

樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法：（1）在貯存溫度（4℃）下，于均勻性檢驗(yàn)完成后的第10、20天，隨機(jī)抽取3個(gè)樣品進(jìn)行檢測；（2）在模擬樣品的運(yùn)輸條件下（2天時(shí)間內(nèi)樣品可送達(dá)各實(shí)驗(yàn)室），將樣品分別置于20℃、36℃和42℃環(huán)境條件下，于均勻性檢驗(yàn)完成后的第3、6天，隨機(jī)抽取3個(gè)樣品檢測。每個(gè)樣品重復(fù)測試2次。定性樣品的測試結(jié)果與樣品指定值（陽性或陰性）均一致時(shí)，說明該樣品符合要求。將定量樣品的測試結(jié)果與均勻性檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，采用T檢驗(yàn)法（依據(jù)CNAS-GL003：2018“5.2”中的內(nèi)容）進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明，樣品之間不存在顯著性差異，滿足實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)樣品要求。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析的設(shè)計(jì)和結(jié)果評(píng)價(jià)原則

定性項(xiàng)目：將參試實(shí)驗(yàn)室的檢測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的指定值（陽性或陰性）進(jìn)行比較，若兩者結(jié)果一致，能力評(píng)價(jià)為“滿意”；若結(jié)果不一致，能力評(píng)價(jià)為“不滿意”。定量項(xiàng)目：參照CNAS-GL002《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》和CNAS-CL01-A001《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》的穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，確定指定值X和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差σ[10-11]，計(jì)算Z比分?jǐn)?shù)（Z值），利用Z值進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)。當(dāng)｜Z｜≤2.0時(shí)，結(jié)果為“滿意”；當(dāng)2.0＜｜Z｜＜3.0時(shí)，結(jié)果為“可疑”；當(dāng)｜Z｜≥3.0時(shí)，結(jié)果為“不滿意”。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測結(jié)果總體情況分析

本次實(shí)驗(yàn)共有65家實(shí)驗(yàn)室參與，收回368個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菌落總數(shù)項(xiàng)目共有63家實(shí)驗(yàn)室參加并報(bào)送結(jié)果，各反饋結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室Z比分?jǐn)?shù)見圖1。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，共有52家結(jié)果為“滿意”，占比82.5%；5家結(jié)果為“可疑”，占比7.9%；6家結(jié)果為“不滿意”，占比9.5%。

圖1 菌落總數(shù)測定結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)分布柱狀圖

大腸菌群項(xiàng)目共有63家實(shí)驗(yàn)室參與，有5家結(jié)果無具體數(shù)值（大于或小于某個(gè)數(shù)值），未參與統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果評(píng)價(jià)，各反饋結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室Z比分?jǐn)?shù)見圖2。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，共43家結(jié)果為“滿意”滿意，占比74.1%；8家結(jié)果為“可疑”，占比13.8%；7家結(jié)果為“不滿意”，占比12.1%。

圖2 大腸菌群測定結(jié)果Z比分?jǐn)?shù)分布柱狀圖

2個(gè)定量項(xiàng)目的檢測結(jié)果見表1。

表1 2個(gè)定量項(xiàng)目結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室家數(shù)及百分比

金黃色葡萄球菌項(xiàng)目共有43家實(shí)驗(yàn)室參與，收回86個(gè)結(jié)果，41家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為“滿意”，占比95.3%；2家結(jié)果為“不滿意”，占比4.7%。

沙門氏菌項(xiàng)目共有38家實(shí)驗(yàn)室參與，收回76個(gè)結(jié)果，37家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為“滿意”，占比97.4%；1家結(jié)果為“不滿意”，占比2.6%。

副溶血性弧菌項(xiàng)目共有22家實(shí)驗(yàn)室參與，收回44個(gè)結(jié)果；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌項(xiàng)目共有18家實(shí)驗(yàn)室參與，收回36個(gè)結(jié)果，均未出現(xiàn)不滿意結(jié)果。

4個(gè)定性項(xiàng)目檢測結(jié)果見表2。

表2 4個(gè)定性項(xiàng)目結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室家數(shù)及百分比

3.2 檢測方法情況

除1家實(shí)驗(yàn)室的副溶血性弧菌項(xiàng)目采用SN/T 0173行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)外，其他實(shí)驗(yàn)室和其他項(xiàng)目均使用GB 4789系列國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。

3.3 不滿意結(jié)果分析

對(duì)本次實(shí)驗(yàn)反饋的結(jié)果進(jìn)行分析，部分實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)可疑或不滿意結(jié)果的原因可能為：

（1）樣品處理不合理。未嚴(yán)格按照參試指導(dǎo)書制備樣品，例如，未充分洗脫西林瓶內(nèi)的樣品或使其出現(xiàn)溢灑；分割一部分樣品進(jìn)行檢測；樣品溶解不充分，導(dǎo)致樣品菌數(shù)發(fā)生變化。

（2）檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)不足。有5家實(shí)驗(yàn)室未能給出大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果的具體數(shù)值，說明其未能充分評(píng)估樣品中的大腸菌群含量，未選擇合適的稀釋梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)未對(duì)樣品充分混勻、移液器使用不規(guī)范、培養(yǎng)基溫度過高等情況，也會(huì)影響檢測結(jié)果。

（3）檢測方法使用不當(dāng)。部分實(shí)驗(yàn)室未能使用現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)，如代碼P7實(shí)驗(yàn)室采用已廢止的標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010和GB 4789.3-2010，代碼P11實(shí)驗(yàn)室采用的SN/T 0173-2010由SN/T 0173-2018替代[12]。

（4）出現(xiàn)假陰性結(jié)果可能原因：培養(yǎng)基質(zhì)量不能滿足實(shí)驗(yàn)要求，未分離出典型菌落；進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)時(shí)，未使用標(biāo)準(zhǔn)菌株作陰陽性對(duì)照；僅挑取1～2個(gè)可疑菌落進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為假陰性時(shí)直接判定結(jié)果。

（5）出現(xiàn)假陽性結(jié)果可能原因：在同時(shí)檢測2份樣品的過程中，發(fā)生了交叉污染，陰性樣品受陽性樣品污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；培養(yǎng)基出現(xiàn)典型或可疑菌落后，未按要求進(jìn)行生化和血清驗(yàn)證就判定為陽性結(jié)果。

4 討論

本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)實(shí)驗(yàn)定量項(xiàng)目結(jié)果的滿意率較低，菌落總數(shù)為82.5%，大腸菌群為74.1%；定性項(xiàng)目結(jié)果的滿意率較高，4個(gè)項(xiàng)目均達(dá)到90%以上。影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有檢測人員、儀器設(shè)備、樣品處理、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、檢測方法、設(shè)施與環(huán)境條件、試劑材料等[13]，在檢測過程中應(yīng)對(duì)這些因素進(jìn)行合理有效的控制。結(jié)果為“不滿意”的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)增加相關(guān)項(xiàng)目的外部質(zhì)控活動(dòng)頻次，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不足和積累經(jīng)驗(yàn)，不斷提升自身檢測業(yè)務(wù)能力，有效控制食品安全風(fēng)險(xiǎn)，確保檢測質(zhì)量符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。