飲用水中腸球菌篩選培養(yǎng)基特異性的比較及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)

劉單單 曾曉琮 周露 楊丹婷 蘇章庭

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東 廣州 510435）

1 前言

隨著工業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)活動(dòng)的增加，水環(huán)境污染問(wèn)題日益加重，飲用水的安全問(wèn)題引起廣泛關(guān)注[1]。腸球菌（Enterococcus），是評(píng)價(jià)水污染程度的重要指示微生物，原歸于鏈球菌屬的D血清群，因其遺傳學(xué)特征和免疫學(xué)性質(zhì)與鏈球菌屬同源程度低，故從鏈球菌屬分離出來(lái)，被列為一個(gè)獨(dú)立的菌屬。原鏈球菌屬分為3個(gè)菌屬：腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和乳球菌屬（Lactococcus）[2-4]，Ez BioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，截至目前，腸球菌屬已發(fā)現(xiàn)60多個(gè)菌種[5]。其中，糞腸球菌（Enterococcus faecalis），是腸球菌屬的代表菌種，是條件致病菌，能夠引起尿路感染、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等多種疾病[6-9]。

腸球菌耐藥性強(qiáng)，與大腸桿菌相比，在水中存活時(shí)間更長(zhǎng)、數(shù)量較少，作為衛(wèi)生質(zhì)量的污染指標(biāo)更具有衛(wèi)生學(xué)意義[10-11]。目前，檢測(cè)飲用水中腸球菌的標(biāo)準(zhǔn)較多，所用的篩選培養(yǎng)基差異較大，GB 8538-2016[12]采用KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基，SN/T 1933.2-2007[13]采用mEI瓊脂培養(yǎng)基，ISO 7899-2000[14]采用Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基及膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂培養(yǎng)基。選擇合適的篩選培養(yǎng)基對(duì)于提高腸球菌的檢測(cè)效率、降低假陽(yáng)性率具有重要意義，但截至目前，還未有研究對(duì)這些培養(yǎng)基的篩選能力和篩選效果進(jìn)行系統(tǒng)研究和比較分析。

基于此，本文以腸球菌屬中具代表性的4個(gè)種共10株菌為培養(yǎng)對(duì)象，基于涂布法和濾膜法研究陽(yáng)性 菌 株 在KF鏈 球 菌 瓊 脂、mEI瓊 脂、Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基、膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂等篩選培養(yǎng)基中的回收率，并對(duì)其特異性進(jìn)行比較，明確最適用于腸球菌的篩選培養(yǎng)基。并采用GB 8538-2016、SN/T 1933.2-2007、ISO 7899-2000這3種標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)自然水樣中的腸球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合MALDITOF-MS技術(shù)，對(duì)腸球菌進(jìn)行鑒定，計(jì)算假陽(yáng)性率，評(píng)價(jià)3種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腸球菌的檢測(cè)效果，以期為飲用水中腸球菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的改善提供重要技術(shù)支撐，為飲用水的衛(wèi)生安全監(jiān)管提供重要科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 原料

2.1.1 樣品來(lái)源

10株腸球菌，分屬于4個(gè)種，具體信息見(jiàn)表1。10個(gè)水樣為輕度污染自然水樣。

表1 10株腸球菌的種屬信息

2.1.2 儀器與試劑

儀器：抽濾設(shè)備、無(wú)菌濾膜（孔徑：0.45 mm，直徑：47 mm，Millipore公司）；高壓滅菌鍋（SX-500，日本TOMY公司）；磁珠保存管（英國(guó)MAST公司）；生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；生物安全柜（AC2-4S1，新加坡ESCO公司）；顯微鏡（AxioScope A1，德國(guó)卡爾蔡司公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（VITEK MS，法國(guó)梅里埃公司）。

培養(yǎng)基：KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基（來(lái)自不同生產(chǎn)廠家）；Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基；mEI瓊脂；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）；腦心浸液瓊脂（BHIA）；平板技術(shù)瓊脂（PCA）；膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂；緩沖蛋白胨水（BPW）；腦心浸液肉湯（BHIB）。

質(zhì)控菌株：大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 8739）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 菌株前處理

菌株活化：分別從各腸球菌的磁珠保存管中取1顆磁珠，置于BHIB中，36℃培養(yǎng)18～24 h；用接種環(huán)取1環(huán)菌液，置于NA中，分離純化，36℃培養(yǎng)18～24 h；挑取單菌落，置于BHIB中，36℃培養(yǎng)18～24 h。此增菌液即為實(shí)驗(yàn)用菌液，挑取1環(huán)，置于NA平板中，生成的單菌落即為工作菌株。

2.2.2 培養(yǎng)基特異性實(shí)驗(yàn)

梯度稀釋?zhuān)何∵m量實(shí)驗(yàn)用增菌液，置于9 mL稀釋液中，使菌濃度達(dá)到0.58±0.02麥?zhǔn)蠞岫?；作?0-1梯度，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蝗?0-7梯度1 mL，置于250 mL無(wú)菌水中，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾；每種培養(yǎng)基2個(gè)平行；吸取0.5 mL至各平板中涂布，每種培養(yǎng)基2個(gè)平行。

回收率計(jì)算及分析：分別對(duì)每個(gè)平板上的腸球菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，與對(duì)應(yīng)的PCA平板的腸球菌平均值相比較，計(jì)算涂布法和濾膜法下不同篩選培養(yǎng)基腸球菌的回收率。利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，比較涂布法和濾膜法下各篩選培養(yǎng)基的生長(zhǎng)效果，明確適合腸球菌生長(zhǎng)的最佳篩選培養(yǎng)基。

2.2.3 培養(yǎng)基選擇性實(shí)驗(yàn)

取10份輕度污染的自然水樣，按照濾膜法，分別經(jīng)0.45 μm濾膜，抽濾250 mL水樣，濾膜至各個(gè)不同培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基2個(gè)平行。分別按照各標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行培養(yǎng)及后續(xù)的驗(yàn)證，另每種平板上篩選出的可疑菌落經(jīng)分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2.2.4 各標(biāo)準(zhǔn)中腸球菌選擇性平板驗(yàn)證方法

GB 8538-2016：用0.45 μm濾膜將250 mL水樣過(guò)濾；將濾膜移至KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)48 h；若出現(xiàn)紅色或粉紅色菌落生長(zhǎng)，需將菌落接種于腦—心浸萃瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行確證試驗(yàn)；若過(guò)氧化氫酶反應(yīng)為陰性，并能在該培養(yǎng)基上于45℃培養(yǎng)后生成菌落，則確證為陽(yáng)性腸球菌。

SN/T 1933.2-2007：用0.45 μm濾膜將250 mL水樣濾膜過(guò)濾；將濾膜置于mEI瓊脂培養(yǎng)基上，41±0.5℃培養(yǎng)21±1 h；若出現(xiàn)帶藍(lán)色暈輪的菌落，需將菌落接種于腦—心浸萃瓊脂和腦—心浸萃肉湯培養(yǎng)基上進(jìn)行確證試驗(yàn)。具有以下特性可確證為陽(yáng)性腸球菌：革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌；可在膽汁七葉苷瓊脂平板上生長(zhǎng)并水解七葉苷，形成黑色或棕色沉淀；可在BHIB肉湯中，45±0.5℃生長(zhǎng)良好；可在含6.5%氯化鈉的BHIB肉湯中，35±0.5℃生長(zhǎng)良好。

ISO 7899-2000：用0.45 μm濾膜將250 mL水樣過(guò)濾；并將濾膜置于Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基后，36±2℃培養(yǎng)44±4 h；若出現(xiàn)中心或整體呈紅色、栗色或粉紅色的菌落，則將濾膜轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至44℃的膽汁—七葉皂苷—疊氮化鈉瓊脂平板中；44±0.5℃培養(yǎng)2 h，立即觀察平板，棕褐色至黑色的所有典型菌落均可視為陽(yáng)性腸球菌。

2.2.5 菌株鑒定

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS），對(duì)篩選的疑似腸球菌進(jìn)行鑒定：從NA板上挑取各腸球菌、質(zhì)控菌的新鮮菌落，置于384孔靶板上點(diǎn)樣；每個(gè)樣品均用1.2 μL HCCA基質(zhì)溶液覆蓋，并在室溫下干燥后用于質(zhì)譜檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同篩選培養(yǎng)基對(duì)陽(yáng)性腸球菌的生長(zhǎng)特異性分析

基于涂布法和濾膜法，研究10株陽(yáng)性腸球菌在KF鏈球菌瓊脂、mEI瓊脂、Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基、膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂等篩選培養(yǎng)基中的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖1。不同培養(yǎng)方法下，各腸球菌菌株在其培養(yǎng)基上的特征與其描述的典型菌落特征一致。

在濾膜法下（圖1A），不同篩選培養(yǎng)基對(duì)菌株的生長(zhǎng)特異性影響較大，其中KF鏈球菌瓊脂（A和B）、mEI瓊脂和膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂對(duì)陽(yáng)性菌株培養(yǎng)的穩(wěn)定性較好，而Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基相對(duì)較差，只對(duì)2株蒙氏腸球菌的培養(yǎng)效果較好。同種篩選培養(yǎng)基對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)特異性影響不大，未表現(xiàn)明顯的菌種特異性。利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)比較濾膜法下各篩選培養(yǎng)基的生長(zhǎng)效果（圖2A），根據(jù)各篩選培養(yǎng)基回收率的平均秩，發(fā)現(xiàn)KF鏈球菌瓊脂（A和B）和mEI瓊脂對(duì)腸球菌的回收率最高，其次為膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂，Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基最低。

圖1 陽(yáng)性腸球菌菌株在不同篩選培養(yǎng)基上的回收率：（A）濾膜法和（B）涂布法

在涂布法下（圖1B），不同篩選培養(yǎng)基對(duì)菌株的生長(zhǎng)特異性影響較大，其中KF鏈球菌瓊脂（A和B）和膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂對(duì)陽(yáng)性菌株培養(yǎng)的穩(wěn)定性較好長(zhǎng)。mEI瓊脂和Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基對(duì)不同菌株的生長(zhǎng)特異性影響較大，mEI瓊脂不適用于蒙氏腸球菌的生長(zhǎng)，Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基不適用于鉛黃腸球菌的生長(zhǎng)。利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)比較涂布法下各篩選培養(yǎng)基的生長(zhǎng)效果（圖2B），根據(jù)各篩選培養(yǎng)基回收率的平均秩，發(fā)現(xiàn)KF鏈球菌瓊脂（A和B）對(duì)腸球菌的回收率最高，其次為膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂，Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基和mEI瓊脂最低。

圖2 利用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)比較陽(yáng)性腸球菌菌株在各篩選培養(yǎng)基的生長(zhǎng)效果：（A）濾膜法和（B）涂布法

綜上可知，KF鏈球菌瓊脂對(duì)陽(yáng)性腸球菌菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定性最好，不同廠家生產(chǎn)的KF鏈球菌瓊脂的效果差別不大。其次是膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂，涂布法和濾膜法均適用。在培養(yǎng)腸球菌方面，mEI瓊脂適宜采用濾膜法，Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基適宜采用涂布法。整體來(lái)看，涂布法比濾膜法的回收率更高，更適宜菌株的生長(zhǎng)。

3.2 不同標(biāo)準(zhǔn)對(duì)自然水樣中腸球菌檢測(cè)結(jié)果的比較

采用GB 8538-2016、SN/T 1933.2-2007、ISO 7899-2000這3種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)10個(gè)輕度污染自然水樣中的腸球菌進(jìn)行檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)和驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 10個(gè)自然水樣在各腸球菌瓊脂培養(yǎng)中的初步結(jié)果

基于GB 8538-2016法，KF鏈球菌瓊脂（A）共長(zhǎng)出3個(gè)可疑菌株，經(jīng)氧化酶試驗(yàn)全部排除；KF鏈球菌瓊脂（B）共長(zhǎng)出6個(gè)可疑菌落，經(jīng)氧化酶試驗(yàn)，其中1個(gè)（9號(hào)）為陰性結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，革蘭氏染色鏡檢為陰性菌株，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，在BHIB 45℃中不生長(zhǎng)，在膽汁液態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，故9號(hào)菌株為非腸球菌。

基于SN/T 1933.2-2007法，mEI瓊脂共有2個(gè)（10號(hào)和11號(hào)）可疑腸球菌，經(jīng)革蘭氏鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性菌株，進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，革蘭氏染色鏡檢均為陽(yáng)性，均可在BEA平板生長(zhǎng)水解七葉苷，均可在BHIB 45℃生長(zhǎng)，但均無(wú)法在35℃的6.5%NaCl BHIB中生長(zhǎng)，故10號(hào)和11號(hào)菌株均為非腸球菌。

基于ISO 7899-2000法，Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基共長(zhǎng)出21個(gè)可疑菌落，根據(jù)膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂進(jìn)行篩選，確認(rèn)共有14株為腸球菌。

采用MALDI-TOF-MS對(duì)菌株的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，能夠有效鑒定菌株的種屬情況[15-16]。本文采用MALDI-TOF-MS技術(shù)，分別對(duì)KF鏈球菌瓊脂（A）、KF鏈球菌瓊脂（B）、mEI瓊脂、Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基等篩選的32株可疑腸球菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。

圖3 不同篩選培養(yǎng)基得到的可疑腸球菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

表3 可疑腸球菌在各檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的驗(yàn)證結(jié)果

（續(xù)表2）

經(jīng)鑒定，KF鏈球菌瓊脂（A）篩選的3株可疑腸球菌株均為腐生葡萄球菌（3株），KF鏈球菌瓊脂（B）篩選到的6株可疑腸球菌株分別為代爾夫特食酸菌（3株）、放射根瘤菌（2株）和銅綠假單胞菌（1株）；mEIA瓊脂篩選的2株可疑腸球菌株分別為綠色氣球菌（1株）和沃氏葡萄球菌（1株）；Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基上篩選的21株可疑腸球菌株分別為嗜麥芽窄食單胞菌（9株）、鮑曼不動(dòng)桿菌（5株）、放射根瘤菌（3株）、沃氏葡萄球菌（2株）、代爾夫特食酸菌（1株）和皮氏羅爾斯頓菌（1株）。結(jié)果顯示，32株可疑腸球菌均為假陽(yáng)性腸球菌，主要為嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、放射根瘤菌、代爾夫特食酸菌、沃氏葡萄球菌。結(jié)合不同標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)腸球菌的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GB 8538-2016、SN/T 1933.2-2007和ISO 7899-2000這3種標(biāo)準(zhǔn)的假陽(yáng)性率分別為0%、0%和100%。

目前，對(duì)腸球菌進(jìn)行篩選最常用、最基礎(chǔ)的方法是平板法，但其后續(xù)驗(yàn)證復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，需要探索快速準(zhǔn)確的初篩方法。本文采用GB 8538-2016、SN/T 1933.2-2007、ISO 7899-2000對(duì)水中的腸球菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KF鏈球菌瓊脂對(duì)陽(yáng)性腸球菌菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定性最好，其次是膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂，涂布法和濾膜法均適用，且適用于各種腸球菌，對(duì)于雜菌的抑制效果也較好。

在濾膜法中，mEI瓊脂培養(yǎng)基對(duì)不同腸球菌株的特異性相對(duì)穩(wěn)定；在涂布法中則相對(duì)較弱，不適宜蒙氏腸球菌的生長(zhǎng)。Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基在涂布法中對(duì)不同腸球菌的特異性較差，可能不適宜涂布法下對(duì)鉛黃腸球菌進(jìn)行篩選。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，GB 8538-2016和SN/T 1933.2-2007雖然后期對(duì)可疑腸球菌的驗(yàn)證復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，但準(zhǔn)確度高，假陽(yáng)性率分均為0%；ISO 7899-2000雖然簡(jiǎn)單快速，但是缺少后期對(duì)可疑腸球菌的生化鑒定，假陽(yáng)性率較高。

表4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果及菌株比例分布表

4 結(jié)論

腸球菌是評(píng)價(jià)飲用水污染程度的重要指示微生物，對(duì)腸球菌進(jìn)行快速篩選和準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)于保障飲用水的質(zhì)量安全具有重要意義。本文研究發(fā)現(xiàn)，不同腸球菌篩選培養(yǎng)基對(duì)陽(yáng)性腸球菌生長(zhǎng)的影響較大，其中KF鏈球菌瓊脂對(duì)不同種腸球菌菌株的生長(zhǎng)穩(wěn)定性最好，其次是膽汁—七葉苷—疊氮化鈉瓊脂，涂布法和濾膜法均適用。mEI瓊脂適宜采用濾膜法對(duì)腸球菌進(jìn)行培養(yǎng)，而Slanetz和Bartley氏培養(yǎng)基適宜采用涂布法對(duì)腸球菌進(jìn)行培養(yǎng)。GB 8538-2016和SN/T 1933.2-2007標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腸球菌檢測(cè)的準(zhǔn)確度較高，而ISO 7899-2000標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腸球菌檢測(cè)的準(zhǔn)確度較低，經(jīng)MALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定，假陽(yáng)性菌株主要為嗜麥芽窄食單胞菌、放射根瘤菌和沃氏葡萄球菌。