HPLC法同時測定忍冬藤配方顆粒中的3種成分

李志嬌 鞏長芹 李學(xué)紅 張曉博

（1.臨沂市檢驗檢測中心 山東 臨沂 276001；2.齊魯制藥有限公司）

1 前言

忍冬藤是忍冬科植物忍冬（Lonicera japora'ca Thunb.）的干燥莖枝，于秋、冬采割曬干，味甘、性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有疏風(fēng)、通絡(luò)、解毒、清熱之功效，常用于治療溫病發(fā)熱、風(fēng)濕熱痹、癰腫瘡瘍、熱毒血痢等病癥[1]，臨床證實其對風(fēng)濕肝病也有一定療效[2]。忍冬藤配方顆粒由忍冬藤飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥而成，具有便于攜帶、免煎易服用、方便貯藏等優(yōu)點[3]。忍冬藤的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類（咖啡酸、綠原酸）和有機酸類（馬錢苷）[4]。本文采用高效液相色譜法測定忍冬藤配方顆粒中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷的含量，以期為忍冬藤配方顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

2 儀器與試藥

2.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國沃特世公司）；十萬分之一電子分析天平（XS205型，瑞士METTLER TOLEDO公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外—可見分光光度計（UV-2401pc）；超純水機（Milli-Q，法國默克）。

2.2 試藥

綠原酸（批號：110753-202018，含量96.1%）、咖啡酸（批號：110885-201703，含量99.7%）、馬錢苷對照品（批號：111640-201808，含量99.0%）（中國食品藥品檢定研究院）；忍冬藤配方顆粒（山東宏濟堂制藥集團股份有限公司3批次：2007001、2007002、2007003；青州堯王制藥有限公司3批次：522008085S、522008086S、522008087S）；甲醇、乙腈（色譜純，Merck KGaA公司）；磷酸為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）—0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，A 10%；15～20 min，A 10%→14%；20～45 min，A 14%→20%，45～50 min，A20%）；檢測波長：236 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液配制

精密稱定綠原酸對照品10.39 mg、咖啡酸對照品10.85 mg、馬錢苷對照品10.33 mg，分別置于100 mL棕色量瓶中；加入50%甲醇溶解，并加入50%甲醇，稀釋至刻度；搖勻，備用。臨用時，分別量取各對照品儲備液2 mL、1 mL、20 mL，置于同一25 mL棕色容量瓶中；加入50%甲醇，稀釋至刻度；搖勻，制成混合對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液配制

取忍冬藤配方顆粒，研細(xì)；精密稱定0.2 g，置于錐形瓶中；精密加入50%乙醇25 mL，稱定重量；超聲提取30 min，放冷，用50%乙醇補足減失重量；搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.2.3 陰性溶液配制

按忍冬藤配方顆粒的處方要求，加入適量輔料，按供試品制備方法，制備成陰性溶液。

3.3 干擾試驗

分別取對照品、樣品溶液及陰性溶液，按“3.1”項的色譜條件，進(jìn)樣，分析。結(jié)果顯示，在樣品色譜圖中，呈現(xiàn)出與對照品保留時間一致的特征峰，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷的保留時間分別為12.17 min、16.88 min、20.36 min，陰性溶液未呈現(xiàn)與對照品保留時間一致的特征峰，表明陰性樣品對所測組分無干擾，理論塔板數(shù)均＞5 000，3種成分的分離度均＞2.0，詳見圖1。

圖1 忍冬藤配方顆粒HPLC圖

3.4 線性關(guān)系

取混合對照品溶液1、2、4、5、8、10 μL，按“3.1”項的色譜條件進(jìn)行測定，記錄液相色譜圖。以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程及其范圍

3.5 精密度

取“3.2”項的對照品溶液，按照“3.1”項的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為5 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積的平均值分別為125 965、119 563、1 260 337，RSD分別為0.43%、0.49%、0.26%，表明儀器的精密度較好。

3.6 重復(fù)性

分別精密稱取同一批次樣品6份 （批號：2007001），按“3.2”項的制備方法制備供試品溶液，按“3.1”項的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積的平均值分別為429 571、166 138、1 186 187；平均含量分別為3.36、0.74、9.48 mg/g；RSD為0.11%、0.50%、0.18%。表明該方法的重復(fù)性良好，可用于檢驗。

3.7 穩(wěn)定性

參考陳娟等[5]的穩(wěn)定性試驗，取忍冬藤配方顆粒（批號：2007001）溶液，置于室溫中；分別在配制后0、2、4、6、8、10、12、24 h，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為5 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷峰面積的平均值分別為125 135、118 776、1 245 638；RSD分別為0.66%、0.67%、1.10%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

3.8 加樣回收

取已知含量的同一批忍冬藤配方顆粒6份（批號：2007001），精密稱取0.1 g，置于具塞錐形瓶中；每份精密加入對照品溶液，按“3.2”項的制備方法制備供試品溶液，按“3.1”項的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μL，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收結(jié)果（n=6）

3.9 含量測定

取6批忍冬藤配方顆粒，按“3.2.2”項的制備方法制備樣品溶液，按“3.1”項的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL，記錄各峰面積，按外標(biāo)法計算，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果表（n=2）

4 討論

4.1 波長的選擇

本文對綠原酸、咖啡酸、馬錢苷進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，得到綠原酸在327 nm、咖啡酸在322 nm、馬錢苷在236 nm處，各有最大吸收，但在236 nm處，均有明顯吸收，故選擇236 nm作為測定波長。

4.2 流動相的選擇

本文參考《中國藥典》2020年版一部中“忍冬藤”和《中國藥典》2015年版一部中“蒲公英”含量測定的流動相[6-7]，流動相有乙腈—0.1%磷酸溶液梯度洗脫；乙腈—0.4%磷酸溶液、甲醇—磷酸鹽緩沖液等度比例，通過試驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈—0.4%磷酸梯度洗脫為流動相，峰形最好，3種成分的分離度高，陰性樣品無干擾。

4.3 提取溶劑方法的選擇

胥愛麗等[3]、姚宣等[8]的試驗考察了以50%甲醇、50%乙醇作為提取溶劑，加入20 mL、25 mL、50 mL提取倍量對檢測的影響，結(jié)果顯示，以25 mL 50%甲醇作為提取溶劑，提取率最高；考察了超聲20 min、30 min、45 min、60 min對檢測的影響，結(jié)果顯示，加入25 mL 50%甲醇、超聲處理30 min與60 min，測得的結(jié)果相差很小，故本文選擇加入25 mL 50%甲醇、超聲處理30 min，作為提取方法，省時簡便。