氣相色譜法測定桑椹中腐霉利殘留量的不確定度評定

金雅慧 宋謝清 秦麗 程靜雯 李阿根*

（1.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測站 浙江 杭州 311100；2.寧波工程學(xué)院奉化研究院；3.杭州市余杭區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)與植物保護服務(wù)站）

1 前言

桑椹，又稱桑果、桑實、桑棗等[1]，為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥果實，含有豐富的維生素、氨基酸和礦物質(zhì)[2]，具有增強抵抗力、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、防癌抗誘變、促進造血細胞生長等作用[3]。果桑菌核病是桑椹生產(chǎn)中的常發(fā)、重要病害，具有減產(chǎn)嚴重、連年暴發(fā)、不易防治等特點，在桑椹的主要種植區(qū)均有發(fā)生，特別是開花期遇多雨天氣或在栽培設(shè)施高濕環(huán)境下，易誘發(fā)病原菌真菌菌核萌發(fā)、子囊盤抽生[4-5]，使發(fā)病率上升。果桑菌核病已成為制約果桑產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，目前藥劑防治仍是實際生產(chǎn)中的主要防治措施。腐霉利（Procymidone）是一種高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，對葡萄孢屬和核盤菌屬真菌防效較好，能防治果樹、蔬菜等作物的灰霉病、菌核病[6]，因其保護效果好、持效期長，在果桑菌核病防治中得到廣泛應(yīng)用[4-5]。

測量不確定度是對測量結(jié)果可疑程度的定量表述，用于評價檢測過程中各因素對測量結(jié)果準確性的影響，為確保檢測結(jié)果準確性，須進行測量不確定度的評定[7-8]。本文按照NY/T 761-2008[9]標準中第2部分的方法一進行檢測，不確定度評估過程參照JJF 1135-2005化學(xué)分析測量不確定度評定[10]、JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[11]，分析、評定腐霉利檢測過程中的各不確定度分量來源及影響因素，以期為相關(guān)人員測定桑椹中其他擬除蟲菊酯類、有機氯類農(nóng)藥殘留量不確定度評定提供參考。

2 材料和方法

2.1 材料和試劑

正己烷、丙酮、乙腈、氯化鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；弗羅里矽固相萃取小柱（規(guī)格1 000 mg/6 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；濾膜（規(guī)格0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；腐霉利標準品（1 000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）。

2.2 儀器和設(shè)備

食品加工器（K600，德國博朗公司）；電子天平（PL202-L，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；氮吹儀（N-EVAP-12，美國Organomation公司）；漩渦混合器（MS3，德國IKA公司）；氣相色譜儀（6890A，配ECD檢測器，美國Agilent公司）；毛細管柱（HP-5型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 標準溶液配制

準確移取0.5 mL腐霉利標準品（1 000 μg/mL），置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，作為標準儲備液。準確移取0.5 mL標準儲備液，置于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，得到0.1 μg/mL標準溶液。

2.3.2 氣相色譜儀參考條件

進樣口溫度：270℃；檢測器溫度：320℃；不分流進樣；載氣：高純氮氣（純度99.99%），恒流模式流速1.0 mL/min；尾吹60 mL/min；柱溫：70℃（保持1 min），以20℃/min升溫至270℃（保持1 min），以1℃/min升溫至285℃（保持5 min）；進樣體積：1.0 μL。

2.3.3 樣品前處理

稱取桑椹樣品25 g，加入乙腈50 mL；經(jīng)組織勻漿機勻漿后，收集濾液；置于盛有7 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩后靜置；從具塞量筒中吸取10 mL上清液，經(jīng)氮吹儀吹至近干；加入2 mL正己烷，將弗羅里矽固相萃取小柱依次用5.0 mL丙酮+正已烷（10+90）、5 mL正已烷預(yù)淋、條件化；待溶劑液面到達固相萃取小柱吸附層表時，倒入上述2 mL待凈化溶液；用5 mL丙酮+正已烷（10+90）淋洗固相萃取小柱，并重復(fù)1次；將盛有淋洗液的刻度離心管經(jīng)氮吹儀吹至小于5 mL，用正已烷準確定容至5 mL；經(jīng)旋渦混合器混勻后，過0.22 μm濾膜至樣品瓶中，以供測定。

2.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)檢測方法，建立桑椹樣品中霉利殘留量的數(shù)學(xué)模型：

式中：ω——桑椹中腐霉利的殘留量（mg/kg）；Va——提取溶劑總體積 （mL）；Vb——吸取上清液體積（mL）；Vc——樣品溶液定容體積（mL）；cref——標準溶液中腐霉利濃度（μg/mL）；A——樣品溶液中農(nóng)藥腐霉利峰面積平均值；As——標準溶液中農(nóng)藥腐霉利峰面積平均值；m——樣品的質(zhì)量（g）；R——樣品加標回收率（%）；fr——樣品均勻性校正因子，1。

3 結(jié)果和分析

3.1 不確定度的來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型及樣品測定過程進行分析，影響桑椹中腐霉利測定結(jié)果的不確定度來源主要為：檢測方法總重復(fù)性；標準溶液配制過程；樣品稱量；樣品前處理過程中的樣品提取液體積、吸取上清液體積、樣品溶液定容體積；樣品的回收率；樣品均勻性校正因子；氣相色譜儀峰面積測量。

由于數(shù)學(xué)模型為乘除形式，可采用相對不確定度評定，且無需計算靈敏度系數(shù)，故桑椹樣品中腐霉利殘留量的相對標準不確定度合成公式為：

式中：u（rep）——峰面積A、As、移液、定容及稱量等操作的重復(fù)性分量，合并而成的一個總實驗的分量，利用ω重復(fù)測量數(shù)據(jù)計算的標準偏差。

3.2 不確定度分量評定

3.2.1 檢測方法總重復(fù)性引入相對不確定度urel（rep）

分別稱取10份樣品，按“2.1”測量中的方法進行測定，結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)測定檢測結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計算標準偏差：

實際測量時，一般對樣品測定2次，以確定測量結(jié)果：

3.2.2 標準溶液配制過程引入相對不確定度urel（crep）

標準溶液配制測量模型為：

式中：cs——標準物質(zhì)濃度（1 000 μg/mL）；V1——移液管移取的標準溶液體積（0.5 mL）；V2——定容時單標線容量瓶體積（50 mL）；V3——移液管移取的標準溶液稀釋后體積（0.5 mL）；V4——再次定容時單標線容量瓶體積（50 mL）。

3.2.2.1 標準物質(zhì)濃度cs引入的相對不確定度urel（cs）

使用有證標準物質(zhì)，腐霉利質(zhì)量濃度標準值為1 000 μg/mL，其標準物質(zhì)證書提供的不確定度為3%，即±30 μg/mL，指明包含因子k=2，則由腐霉利標準品本身濃度引入相對標準不確定度為：

3.2.2.2 標準溶液配制過程中由量具、溶劑膨脹引入相對不確定度urel（Vi）（i=1～4）

JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[12]規(guī)定：20℃時，1 mL分度移液管的最大允許誤差MPE為±0.008 mL，根據(jù)均勻分布，k=。50 mL單標線容量瓶的MPE為±0.05 mL，根據(jù)三角分布，k=。實驗室溫度為（20±5）℃，正己烷體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，由此產(chǎn)生的體積變化根據(jù)均勻分布，k=。

3.2.2.3 標準溶液配制過程引入相對不確定度urel（crep）

3.2.3 樣品稱量引入相對不確定度urel（m）

查閱檢定證書，樣品稱量所用電子天平的MPE為±0.05 g，根據(jù)均勻分布：

3.2.4 樣品前處理過程中樣品提取液體積、吸取上清液體積、樣品溶液定容體積引入相對不確定度urel（Va）、urel（Vb）、urel（Vc）

JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[12]規(guī)定，20℃時，50 mL量筒的MPE為±0.25 mL；10 mL分度移液管的MPE為±0.05 mL；5 mL刻度離心管的MPE為±0.1 mL，根據(jù)按均勻分布，k=。實驗室溫度為（20±5）℃，乙腈、正己烷的體積膨脹系數(shù)分別為1.37×10-3/℃、1.37×10-3/℃，由此產(chǎn)生的體積變化根據(jù)均勻分布，k=。

3.2.5 方法回收率引入相對不確定度urel（R）

對5份陰性桑椹樣品進行腐霉利加標實驗（添加濃度0.010 mg/kg），回收率分別為105.3%、96.6%、94.0%、96.0%、101.6%，平均回收率為98.7%。

回收率引入的不確定度采用A類評定中的極差法進行評定：

平均回收率要進行t顯著性檢驗：

說明回收率R不必在測量模型中采用修正測定結(jié)果，但其對不確定度的貢獻須考慮。

3.2.6 樣品的均勻性校正因子fr引入的相對不確定度urel（fr）

根據(jù)檢測方法，平行配制3份樣品，采用氣相色譜儀分別進行測定，其數(shù)據(jù)為：0.906 mg/kg、0.915 mg/kg、0.912 mg/kg，據(jù)JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[11]，極差系數(shù)C為1.69。

以2次測量平均值為其測量結(jié)果：

3.2.7 色譜儀峰面積測量值引入的相對不確定度urel（A）

3.2.7.1 氣相色譜儀進樣體積引入的相對不確定度urel（Ve）

氣相色譜儀進樣器配備10 μL微量注射器進樣，其使用說明書標明定量重復(fù)性為1.0%，即其重復(fù)性相對標準偏差：

3.2.7.2 氣相色譜儀檢測器引入的相對不確定度urel（A1）

氣相色譜儀檢定證書標明其定量重復(fù)性為1.3%，即其區(qū)間半寬度為0.013，根據(jù)矩形分布，k=，則可得相對標準不確定度：

3.2.7.3 色譜儀峰面積測量值引入的相對不確定度urel（A）

3.3 合成標準不確定度

由上述計算得到的各分量相對標準不確定度結(jié)果見表2，合成桑椹樣品中腐霉利殘留量的相對標準不確定度為：

表2 測定過程中各相對標準不確定度分量統(tǒng)計結(jié)果

已知2次測定值的平均值為0.353 mg/kg：

3.4 擴展不確定度和結(jié)果表示

取包含因子k=2，按95%置信概率，合成標準不確定度與包含因子相乘，計算得到測量結(jié)果的擴展不確定度為：

U=k×u（ω）＝2×0.01271＝0.02542≈0.025（mg/kg）

當測得桑椹中腐霉利殘留量為ω'=0.353mg/kg時，其測量結(jié)果為：

ω=ω'±U=（0.353±0.025），k=2

4 結(jié)論

本文按照NY/T 761-2008[9]標準中第2部分的方法一，采用氣相色譜法測定桑椹中腐霉利的殘留量，根據(jù)數(shù)學(xué)模型及樣品測定過程，分析、評定各不確定度分量，結(jié)果顯示，各分量中方法回收率和標準溶液配制對總相對標準不確定度貢獻率分別為37.0%、35.0%，對檢測結(jié)果影響較大。在實際檢測過程中，應(yīng)加強實驗室質(zhì)量管理，通過技術(shù)培訓(xùn)、人員比對、制定SOP操作手冊等，不斷提升檢測水平和操作規(guī)范性，并對儀器設(shè)備進行定期校準和維護，做好環(huán)境條件控制，以保證檢測結(jié)果的準確可靠。