高效液相色譜—光化學(xué)衍生法測定杜仲葉中的黃曲霉毒素

李本淳 張強(qiáng) 張亦萌 馬彧

（四平市食品藥品檢驗(yàn)所 吉林 四平 136000）

1 前言

杜仲葉是杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）的干燥葉，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，可用于治療肝腎不足、頭暈?zāi)垦！⒀ニ嵬?、筋骨痿軟。黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素，其衍生物有約20種，分別命名為B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等，其中，B1的毒性最大，致癌性最強(qiáng)。

黃曲霉毒素主要存在于農(nóng)產(chǎn)品、飼料和中藥材中，溫度、濕度、空氣是黃曲霉毒素生長繁殖的必要條件。雖然《中國藥典》2020年版規(guī)定了13種中藥材的黃曲霉毒素限量，但部分市售藥材仍存在黃曲霉毒素污染甚至超標(biāo)等現(xiàn)象。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉采摘后若不及時(shí)晾曬或貯藏方式不當(dāng)，宜發(fā)霉變質(zhì)，故本文采用高效液相色譜-光化學(xué)衍生法測定杜仲葉中黃曲霉毒素的含量，以期為杜仲葉的安全性評價(jià)提供參考。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

高效液相色譜儀（1260型，美國安捷倫）；均質(zhì)器（青島普瑞邦）；臺式離心機(jī)（TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子天平（BT125D型，賽多利斯）。

2.2 試劑

黃曲霉毒素混合對照品溶液（批號：610001-202006，特性量值：AFB1為1.04 μg/mL、AFB2為0.38 μg/mL、AFG1為1.08 μg/mL、AFG2為0.38 μg/mL，中國食品藥品檢定研究院，）；免疫親和柱（青島普瑞邦）。甲醇、乙腈均為色譜純，氯化鈉為分析純，杜仲葉來源為市售，水為自制超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速：1 mL/min；激發(fā)波長：360 nm，發(fā)射波長：450 nm；柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。采用柱后光化學(xué)衍生法，熒光檢測器，2個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。

3.2 混合對照品溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取杜仲葉粉末約10 g（過2號篩），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中；加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（＞11 000 r/min），離心5 min（4 000 r/min）；精密量取上清液15 mL，置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心10 min（4 000 r/min）；精密量取上清液20 mL，通過免疫親合柱，流速3 mL/min；用20 mL水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進(jìn)入，將水?dāng)D出；用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中；加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 空白溶液的制備

除不添加樣品外，按“3.3”中的方法制備空白溶液，即得。

3.5 專屬性試驗(yàn)

分別吸取空白溶液、對照品混合溶液和供試品溶液20 μL，在“3.1”中的色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，各色譜峰分離良好，空白溶液無相同色譜峰出現(xiàn)，表明空白無干擾，見圖1。

圖1 杜仲葉黃曲霉毒素HPLC圖

3.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“3.2”混合對照品溶液5 μl、10 μl、15 μl、20 μl、25 μl、30 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），黃曲霉毒素的進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計(jì)算。各成分在線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。將黃曲霉毒素混合對照品溶液加入空白樣品進(jìn)行分析，以基線噪聲（S/N>3）確定方法檢出限，見表1。

表1 黃曲霉素度對照品線性關(guān)系及檢出限

3.7 重復(fù)性考察

精密稱取同一杜仲葉6份，每份10 g，分別精密加入對照品貯備液適量，按“3.3”中的方法制備供試品溶液，在“3.1”中的色譜條件下進(jìn)行測定，測得4種黃曲霉毒素含量的RSD均在2.5%以內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別于0、2、4、8、12和24 h，精密吸取重復(fù)性考察項(xiàng)同一供試品溶液20 μL，按“3.1”中的色譜條件進(jìn)行測定，4種黃曲霉毒素峰面積的RSD均小于2.3%，表明供試品溶液中4種黃曲霉毒素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一不含4種黃曲霉毒素的杜仲葉6份，每份10 g，分別精密加入對照品貯備液0.7 ml，按“3.3”中的方法制備供試品溶液，按“3.1”中的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分別為94.0%、93.1%、92.7%、92.4%，RSD分別為2.5%、3.7%，3.5%，2.9%，表明該方法的回收率良好。

3.10 樣品的黃曲霉毒素含量測定

取來自貴州、四川、安徽等地的杜仲葉15批，按“3.3”中的方法制備供試品溶液，按“3.1”中的色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，均未檢出黃曲霉毒素。

4 討論

本文通過對15批不同產(chǎn)地的杜仲葉中的黃曲霉毒素進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，杜仲葉不易受到黃曲霉毒素的污染。我國常用中藥有300余種，《中國藥典》2020版僅對易產(chǎn)生黃曲霉毒素的果實(shí)、種子等類型的部分中藥材做出了規(guī)定，但是其他類型的中藥材在儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中也有可能受黃曲霉毒素污染，應(yīng)制定黃曲霉毒素快速檢測方法，擴(kuò)大考察中藥材品種范圍，應(yīng)用現(xiàn)代的理化、生物技術(shù)對易霉變中藥材開展科學(xué)的養(yǎng)護(hù)，保障中藥的安全性。