蘄蛇實時熒光定量PCR快速鑒別方法的建立

裴社強 楊寶

（山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術(shù)研究所 山西 太原 030000）

1 前言

蘄蛇（Agkistrodon）為蝰科動物五步蛇的干燥體，多將其于夏、秋季捕捉，剖開蛇腹，除去內(nèi)臟，洗凈，用竹片撐開腹部，盤成圓盤狀，干燥后拆除竹片，有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效[1]，臨床常用于風(fēng)濕、腫瘤和心腦血管類疾病的治療[2-5]。蘄蛇作為貴重的動物藥材，臨床功效確切，商品來源復(fù)雜，藥材形態(tài)鑒別較為困難。近年來，由于野生資源逐漸匱乏，且價格昂貴，市場上出現(xiàn)蛇類偽品和混淆品甚多，且僅憑外部形態(tài)特征難以準(zhǔn)確辨認(rèn)[6]。從已報道的研究文獻來看，蘄蛇的有效成分尚不明確，暫未發(fā)現(xiàn)蘄蛇的專屬性檢測化學(xué)成分，而傳統(tǒng)的性狀鑒別方法需要豐富的鑒別經(jīng)驗，由于蘄蛇本身價格昂貴，成方用量少，市售多為飲片產(chǎn)品，更增加了其鑒別難度。隨著分子鑒定技術(shù)的引入，中國藥典2010年版一部鑒別項下增加了蘄蛇的PCR鑒定，該方法用時較長，需要電泳檢測，無法適應(yīng)現(xiàn)場鑒定的需要[7]。

分子生物學(xué)能夠從基因水平對蘄蛇成分進行鑒定，與傳統(tǒng)檢測方法相比，其具有特異性強、靈敏度高、可操作性強等特點，目前在中藥材真?zhèn)舞b別領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。近年來，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）技術(shù)的飛速發(fā)展，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，使得成分含量的定量溯源成為可能[8]。本文基于蘄蛇CO1序列的特異性位點設(shè)計引物，同時結(jié)合藥材快速提取技術(shù)[9]，引入TaqMan熒光探針，以期建立快速準(zhǔn)確鑒別蘄蛇真?zhèn)蔚姆椒ǎ瑸樗幉氖袌?、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料

高速冷凍離心機（Neofuge 13R，香港力康）；微量核酸分析儀（eppendorf）；熒光定量PCR儀（ABI 7500fast，美國熱電）；梯度PCR儀（BIO-RAD C1000 TOUCH）；電泳儀（Power Pac Basic）；凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂）；TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（Tkara，Cat#9765）；Taq-ManTMFast Universal PCR Master Mix（2X）（ABI，NO.4366072）。引物、探針由上海生工生物公司合成。

本文共收集蘄蛇藥材及其易混偽品14個物種25份樣品，樣品來源于廣州清遠、廣西玉林、吉林通化、大連市藥檢所、桂林市藥檢所及太原市藥店醫(yī)院和生產(chǎn)企業(yè)等地，經(jīng)山西省食品藥品檢驗所主任藥師羅晉萍鑒定，保存于太原市食品藥品檢驗所，樣品信息詳見表1和表2。

表1 蘄蛇樣品信息

表2 蘄蛇混偽品信息

（續(xù)表2）

2.2 儀器

萬分之一分析天平（204，梅特勒公司）；純水儀（Milli-Q，Millipore公司）；球磨儀（MM400，Retsch公司）；高速冷凍離心機（Neofuge 13R，香港力康公司）；微量核酸分析儀（eppendorf公司）；實時熒光定量PCR儀（MyGo Pro，IT-IS公司）。

2.3 試劑

聚乙烯吡咯烷酮40（PVP 40，上海遠慕生物科技有限公司）；Triton X-100（上海生工生物技術(shù)有限公司）；定性濾紙（杭州雙圈濾紙有限公司）；石蠟（萊卡公司）；擴增試劑TaqManTMFast Universal PCR預(yù)混液（2X，ABI，NO.4352042，賽默飛世爾科技中國有限公司）。引物由大連寶生生物有限公司合成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

2.4 方法

2.4.1 樣品DNA提取

為提高提取效率，本文采用楊璐等[9]開發(fā)的實驗方法，具體如下：用剪刀將濾紙裁剪成44 mm×2 mm的長方形濾紙條，將其一端浸入加熱融化的石蠟中；待晾干后形成40 mm×2 mm的疏水手柄區(qū)域，以便轉(zhuǎn)移濾紙條，前端未浸漬石蠟的部分則為核酸結(jié)合區(qū)，用于后續(xù)的核酸吸附；為避免污染，用75%酒精棉球?qū)悠繁砻娌潦酶蓛?，晾干，將干品用球磨儀粉碎成細粉狀；稱取經(jīng)液氮研磨后新鮮或干燥藥材粉末0.05～0.20 g，置于2 mL離心管中，研磨；加入500 μL裂解液，將樣品裂解7 s；將濾紙圓盤浸入裂解液中3 s，以吸附核酸；將圓盤轉(zhuǎn)移至1 750 μL清洗液中3 s，以清洗表面吸附的雜質(zhì)；將圓盤轉(zhuǎn)移至配制好的反應(yīng)體系中。該方法與濾紙條法的不同之處，在于圓盤是保留在擴增體系中。

2.4.2 引物的設(shè)計與擴增

引物的設(shè)計：通過查閱文獻和檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得蘄蛇及其他常見近源物種序列，根據(jù)引物和Taq Man探針的設(shè)計原則，經(jīng)過Oligov7.0.1設(shè)計出能夠用于蘄蛇真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR檢測引物和探針，將設(shè)計的引物和探針序列在NCBI的Blast中進行搜索和比對，確定其特異性。

探針：5'FAM-TCCGGAGAGAGGTGGATAGAC GGT-TAMARA3'

上游引物：5'-ACTACTGCCCCCAGCATTACT-3'

下游引物：5'-CACTGATGGGCCGGAGTGTA-3'

擴增反應(yīng)體系配制見表3。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性20 s，95℃變性3 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。

表3 反應(yīng)體系配制表

2.4.3 特異性實驗

特異性實驗見表2，提取表2中樣品的DNA作為模板。按照“2.4.2”中的反應(yīng)體系和條件進行擴增，同時以滅菌雙蒸水作為空白對照，驗證引物和探針對蘄蛇樣品擴增的特異性。

2.4.4 樣品覆蓋度實驗

筆者攜帶快速檢測儀器MyGo Pro實時熒光定量PCR儀及試劑，赴山西省國藥集團進行快速檢測，以表1中5批蘄蛇的DNA為模板，按照“2.4.2”中的反應(yīng)體系和條件進行擴增，以滅菌雙蒸水作為空白對照，進行覆蓋度試驗。

2.4.5 靈敏度實驗

將50 ng的蘄蛇DNA模板用滅菌雙蒸水10倍遞減稀釋，稀釋濃度從高到低分別為：50、5、0.5、0.05、0.005 ng/μL，每個梯度進行5次平行實驗，按照“2.4.2”中的反應(yīng)體系和條件進行擴增，驗證該方法的靈敏度。

3 結(jié)果與分析

3.1 特異性實驗

如圖1所示，空白對照無FAM熒光對數(shù)擴增曲線；非蘄蛇類樣品無明顯的FAM熒光對數(shù)擴增曲線，Ct值均＞40；陽性對照蘄蛇對照藥材有FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值＜35，證明實驗有效。

圖1蘄蛇特異性實驗

3.2 樣品覆蓋度實驗

圖2 為筆者赴山西省國藥集團進行5批蘄蛇樣品快速檢測的結(jié)果，經(jīng)1 min快速提取，5批樣品在40個循環(huán)中，均產(chǎn)生明顯的熒光對數(shù)擴增曲線，Ct值均＜35，實驗全過程不超過30 min，能夠有效、準(zhǔn)確地鑒別蘄蛇，經(jīng)過專家鑒定和DNA條形碼測序結(jié)果的比對，結(jié)果完全一致，證明該方法適用于市售蘄蛇的真?zhèn)舞b別。

圖2 蘄蛇樣品覆蓋度實驗

3.3 靈敏度實驗

按“2.4.2”中方法進行PCR擴增，將所得Ct值進行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，曲線有明顯的對數(shù)增長，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均＜3.5%，擴增結(jié)果具有良好的重復(fù)性：y=-3.391x+18.862，R2=0.999，線性相關(guān)度良好。根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出，Ct值為35時，蘄蛇DNA的質(zhì)量濃度為0.5 pg/μL，該實時熒光PCR體系的靈敏度為0.5 pg/反應(yīng)。

圖3 蘄蛇樣品靈敏度擴增圖譜

圖4 蘄蛇樣品靈敏度擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線

4 討論

目前，蘄蛇鑒別的經(jīng)典方法為形態(tài)學(xué)[10]，當(dāng)蘄蛇藥材保存完整時，可通過其外觀形態(tài)的典型特征進行鑒定，但是，若藥材已被切成段狀，通過性狀就難以準(zhǔn)確鑒別[11]。長期以來，研究人員普遍認(rèn)為動物類中藥的有效成分為其中的蛋白類成分，可通過胃腸道的消化吸收進入人體以發(fā)揮作用，但未見蘄蛇具有專屬性特殊藥理活性氨基酸類成分的報道[12]，故采用分子生物學(xué)檢測具有極大優(yōu)勢。現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中國藥典2010年增補版開始采用PCR檢測方法鑒別蘄蛇真?zhèn)?，但該方法為普通PCR法，需要電泳檢測，檢測耗時長，無法滿足現(xiàn)場檢測需求。

CO1是細胞色素氧化酶1基因的序列，其對動物鑒定的有效性已在多個類群中得到驗證，成為動物條形碼的核心序列[13]，故CO1分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于中藥材的鑒定。本文依據(jù)中國藥典2020年版四部[14]和陳士林[13]對中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，基于CO1分子標(biāo)記，設(shè)計了特異性鑒別蘄蛇的引物和TaqMan探針，在40個循環(huán)內(nèi)，蘄蛇對照藥材（山西省國藥集團樣品）有熒光對數(shù)擴增曲線，其他非蘄蛇樣品無熒光對數(shù)擴增曲線，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本實驗方法全程僅需20～40 min，而標(biāo)準(zhǔn)方法需要2 h以上；本實驗方法使用儀器采集熒光判讀結(jié)果，靈敏度更高，達到0.5 pg/反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)方法為普通PCR法，需要進行電泳實驗；本實驗方法全過程閉環(huán)操作，降低假陽性率，避免電泳時核酸染色劑對人員及環(huán)境造成危害；本實驗方法操作較為簡單，業(yè)務(wù)不熟練的人員也能夠快速掌握，檢測結(jié)果與形態(tài)學(xué)生藥鑒定結(jié)果及DNA條形碼測序結(jié)果完全吻合，具有極強的可靠性和穩(wěn)定性。

5 結(jié)論

本文對市售蘄蛇樣本進行熒光PCR檢測分析，并進行特異性實驗、靈敏度實驗、樣本覆蓋度實驗，結(jié)果表明，本文建立的引物和TaqMan探針使非蘄蛇類樣品及陰性對照未產(chǎn)生費特異性擴增，有利于結(jié)果判讀，可有效鑒別蘄蛇中藥材真?zhèn)?，全過程閉環(huán)操作，無需PCR后處理，實驗結(jié)果由儀器顯示，避免主觀誤差，本實驗方法具有檢測專屬性強、準(zhǔn)確率高、簡單快速、無污染等優(yōu)點，能夠為蘄蛇真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。