改良Alu-PCR技術檢測HepG2.2.15細胞HBV整合的研究

阮鵬 何春萍 黃超 周瑞

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行。慢性乙型肝炎(CHB)可以導致肝細胞癌(HCC), HBV感染過程中病毒整合入肝細胞是HBV相關性HCC的重要誘因[1]。HBV感染后，病毒成熟體(Dane顆粒)黏附于宿主肝細胞表面并進入肝細胞內(nèi)，部分病毒基因成份進入肝細胞核內(nèi)部，疏松環(huán)狀結構(rcDNA)轉變成共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)，有部分DNA片斷整合入宿主細胞核。HBV整合的檢測方法包括Alu-PCR，反向巢式PCR (invPCR)，高通量測序技術(WGS)等[ 2-4]，大多耗時費力或價格昂貴。本研究探討通過改良Alu-PCR技術檢測HBV整合的可能性，現(xiàn)報告如下。

材料和方法

一、細胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) HepG2和HepG2.2.15細胞(上海復祥生物科技有限公司)，DNA通過QIAamp○RDNA Mini試劑盒(Qiagen)抽提。Alu-PCR定量檢測HBV整合位點，采用48孔培養(yǎng)平板再次培養(yǎng)HepG2.2.15細胞。 20 μmol/L雙氧水(H2O2)加入其中24孔，抽提細胞作為治療組。另外24孔細胞未加入H2O2作為對照組 。

二、 HBV整合檢測

將傳統(tǒng)HBV檢測的Alu-PCR技術進行改良簡化。Alu序列引物包括外側引物A5(5′CAGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCCAAAGTGC-TGGGATTACAG 3′，5′末端劃線部分為附加于Alu序列外的Tag序列) 和內(nèi)側引物Tag5(5′ CAAGTGTTTGCTGACGCCAAAG 3′)。設計HBV序列外側引物 HB1(5′ AAAGGACGTCCCGCGCAG 3′) 和內(nèi)側引物HB2 (5′ CACAGCCTAGCAGCC-ATGG 3′)(上海生工科技有限公司合成)。對HepG2和HepG2.2.15細胞中提取的DNA均采用Alu-PCR技術檢測進行比較。第一輪擴增的引物為A5和HB1。在25 μL PCR體系中含2.5 μL PCR 10×Taq緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、10 μmol/L引物各1 μL、1 μL細胞DNA，0.1 μLTaqDNA聚合酶，加ddH2O至總體積25 μL。94℃預變性1 min，每次循環(huán)包括94℃ 30 s，59℃ 30 s，70℃ 3 min，進行10個循環(huán)擴增，94℃ 1 min中止反應。PCR體系中加入引物A5和HB1各0.5 μL進行降落PCR。94℃預變性1 min，94℃ 30 s、65℃降落至55 ℃，72 ℃ 3 min的條件下進行10次循環(huán)(每輪循環(huán)降1℃)，再在退火溫度保持55℃的條件下進行20次循環(huán)。然后取1 μL PCR產(chǎn)物做模板，采用引物Tag5和HB2進行第二輪擴增，除引物和DNA模板外，PCR體系其他成分同前。擴增條件最終優(yōu)化為：94℃預變性2 min，每次循環(huán)包括95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s共40個循環(huán)擴增，72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，PCR產(chǎn)物凝膠回收后送大連寶生物公司測序，結果經(jīng)美國國家生物技術信息中心(NCBI)BLAST檢索(BLAST; http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr)。

三、HepG2.2.15細胞HBV整合位點和cccDNA定量檢測

對加入和未加入H2O2的HepG2.2.15細胞中檢測到的HBV整合位點及cccDNA進行定量檢測。凝膠回收用改良Alu-PCR法擴增出的HepG2.2.15細胞HBV整合片段，PMD 18-T載體連接后轉染DH5α感受態(tài)細胞。加入LB液體培養(yǎng)基使細菌恢復正常生長狀態(tài)后涂布于LB瓊脂平板上培養(yǎng)。藍、白斑篩選、質粒抽提并10倍稀釋制作標準品。為進行該整合位點定量檢測，根據(jù)測序結果設計Alu-R引物(5′ AAAGTGCTGGGATTACAG 3′)和HB2配對。采用SYBR Green I 熒光定量PCR(RT-PCR)技術，20 μL反應體系中含1 μL細胞DNA、10 μmol/L引物各1 μL、7 μL ddH2O和10 μL 2X SYBR Green I。反應條件同Alu-PCR第二輪擴增，72℃采集熒光信號。RT-qPCR檢測細胞cccDNA水平[5]。 LightCycler control DNA試劑盒檢測β-珠蛋白DNA來計算肝組織細胞數(shù)目。

四、統(tǒng)計學方法

結 果

一、HBV整合檢測

改良Alu-PCR法在HepG2.2.15細胞中擴增出194 bp片段，HepG2細胞中則未擴增出(圖1)。 測序分析顯示該片段包括158 bp的HBV序列、20 bp的Alu重復序列及16 bp的Alu引物中Tag序列，為一插入Alu序列的HBV整合特異性擴增片段，其病毒結合位點位于1 228 nt。該位點病毒整合片段長度至少為193 bp (1 421～1 228 nt)，因為HB1引物的序列為1 421～1 404 nt(圖2)。

注：M.DNA Marker(DL 100bp)；1.HepG2細胞；2.HepG2.2.15細胞

注：A. 嵌合體片斷Sanger測序結果；B. 病毒-宿主嵌合端BLAST檢索：包含3bp的同源序列(CTG)，病毒結合處為P區(qū)1 228nt

二、HepG2.2.15細胞中該整合位點及cccDNA的定量檢測

加入H2O2的HepG2.2.15細胞中該整合位點水平為(-1.13±0.07)lg拷貝/細胞，未加入H2O2的HepG2.2.15細胞中其水平為(-2.10±0.82)lg拷貝/細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。加入H2O2的HepG2.2.15細胞中cccDNA水平為(-1.94±1.45)lg拷貝/細胞，未加入H2O2的HepG2.2.15細胞中其水平為(-1.79±1.40)lg拷貝/細胞，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.915)。HepG2.2.15細胞該整合位點和cccDNA水平無顯著相關性(P=0.463)。

討 論

HBV整合的致癌機制包括：①影響整合位點周圍宿主基因的功能，如抑癌基因的失活或表達抑制、或癌基因的過表達激活；②宿主細胞基因組不穩(wěn)定；③免疫逃避下的克隆擴增等[6,7]。Alu-PCR是利用宿主基因中大約每間隔4 kb存在一段Alu重復序列的特點，設計一對HBV和Alu重復序列的嵌合引物，從而檢測出HBV 與肝細胞DNA結合位點的經(jīng)典技術。其技術要點包括:①為避免Alu引物間的重復擴增，Alu引物中的三磷酸脫氧胸腺苷酸(dTTP)用三磷酸脫氧尿苷酸(dUTP)代替。在擴增10個循環(huán)之后，反應體系中加入1 μL尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)來滅活dUTP從而破壞Alu引物；②第二階段采用降落PCR用來提高反應的特異性和敏感性；③為提高擴增效率，采用非對稱PCR技術(HBV引物濃度為Alu引物濃度的10倍)[2]。其缺陷在于無法檢測到遠離Alu重復序列的HBV整合片段。

本研究將傳統(tǒng)Alu-PCR技術改良如下: ①Alu引物中仍采用dTTP從而有效降低實驗費用(dUTP價格昂貴)，無需在降落PCR前加入UDG來破壞Alu引物；②HBV引物和Alu引物濃度相同；③重新設計位于P區(qū)的HBV引物。結果表明：①HBV整合片段在HepG2.2.15細胞并未在HepG2細胞中擴增出來，證明其為特異性而不是宿主-宿主基因或病毒-病毒基因的非特異性擴增片段；②該HBV整合位點的嵌合片段宿主端為Alu重復序列，病毒結合端為HBP(1 228 nt)，長度僅為194 bp，有效避免了傳統(tǒng)Alu-PCR檢測中HBV整合位點可能遠離Alu重復序列無法測出、長片段PCR可導致非特異性擴增等缺陷；③該整合位點嵌合片段有3 bp的同源序列(CTG)，提示其病毒-宿主基因的連接方式為微同源末端連接[8]。

HBV整合是CHB患者致癌的重要誘因之一，但其發(fā)生機制和時間并不十分清楚。研究表明，HBV持續(xù)感染可使肝細胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)產(chǎn)量增多，導致細胞DNA雙鏈斷裂(DSB)加重其細胞損傷并形成惡性循環(huán)。另一方面，ROS對肝細胞DNA的持續(xù)損傷可導致整合肝細胞選擇性克隆擴增、整合片段通過失去復制能力從而逃避宿主免疫反應[1]。由于H2O2可導致靶細胞DSB形成，可以通過在HepG2.2.15細胞內(nèi)加入H2O2來模擬ROS導致細胞損傷[9]。本研究通過加入H2O2從而加重HepG2.2.15細胞DNA損傷，并定量檢測該插入Alu重復序列整合位點來探討HBV持續(xù)感染所導致的整合肝細胞克隆擴增情況。結果表明，加入H2O2的HepG2.2.15細胞中該整合位點水平顯著高于未加入H2O2的細胞，證明在肝細胞持續(xù)損傷狀態(tài)下存在整合細胞的優(yōu)勢擴增并可能導致HCC發(fā)生。cccDNA是HBV原始復制模板，是宿主肝細胞持續(xù)感染和抗病毒治療后產(chǎn)生耐受和停藥后復發(fā)的關鍵。本研究表明加入H2O2的HepG2.2.15細胞中cccDNA水平未顯著高于未加入H2O2的HepG2.2.15細胞，所檢測的細胞該整合位點和cccDNA水平?jīng)]有顯著相關性。這種差異可能源于cccDNA和HBV整合的不同來源：前者主要來源于rcDNA反復進入肝細胞核，后者則可能來源于整合肝細胞的克隆擴增[10]。

總之，通過重新設計HBV引物、采用改良Alu-PCR技術在HepG2.2.15細胞中檢測到插入Alu重復序列的HBV整合位點，有效簡化了實驗步驟和節(jié)省實驗費用，降低了HBV整合研究的門檻。對該整合位點的定量檢測顯示肝細胞持續(xù)損傷可導致HBV整合細胞的優(yōu)勢克隆擴增，其插入病毒序列全長、對鄰近基因的調控作用等有待進一步研究。